金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型TIMP-1及HA等的影響

曹正柳， 資曉飛， 熊耀斌， 謝慶斌， 傅 纓， 冷紅文， 李劍琦， 俞 紅， 龔媛媛

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西南昌330006;2.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，江西南昌330006;3.江西濟(jì)民可信醫(yī)藥有限公司，江西南昌330096)

肝纖維化是肝損傷持續(xù)存在，組織發(fā)生修復(fù)反應(yīng)時(shí)，因細(xì)胞外基質(zhì)合成、降解與沉積不平衡而引起的病理過程，是慢性肝病重要的病理特征，也是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)［1］。本試驗(yàn)以皮下注射四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝損傷，形成肝纖維化動(dòng)物模型。通過觀察金水寶膠囊對(duì)肝纖維化模型大鼠TIMP—1及HA等的影響，研究金水寶膠囊抗肝纖維化的療效及可能的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)SD大鼠68只，體質(zhì)量180～200 g，雄性，分籠飼養(yǎng)，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司處購(gòu)買，動(dòng)物合格證2008-0016。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 金水寶膠囊(蝙蝠蛾擬青霉Cs-4發(fā)酵菌粉)由江西濟(jì)民可信金水寶制藥有限公司生產(chǎn)提供。

1.3 試劑 四氯化碳，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑公司，批準(zhǔn)號(hào):20080908，以純橄欖油配成40%的油劑。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與用藥 隨機(jī)分成5組。各組用藥劑量按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究“等效劑量”計(jì)算方法確定［2］。除A組外，各組均用CCl4造模。A組:空白對(duì)照組，10只，同等條件下喂養(yǎng)，不給藥，各鼠每天灌服2 mL生理鹽水。B組:模型對(duì)照組，16只，不給藥，各鼠每天灌服2 mL生理鹽水。C組:金水寶膠囊(蝙蝠蛾擬青霉Cs-4)小劑量治療組，14只，以金水寶膠囊(蝙蝠蛾擬青霉Cs-4)按40 mg/100 g體質(zhì)量/日灌胃。D組:金水寶膠囊(蝙蝠蛾擬青霉Cs-4)中劑量治療組，14只，以金水寶膠囊(蝙蝠蛾擬青霉Cs-4)按80 mg/100 g體質(zhì)量/日灌胃。E組:金水寶膠囊(蝙蝠蛾擬青霉Cs-4)大劑量治療組，14只，以金水寶膠囊(蝙蝠蛾擬青霉Cs-4)按160 mg/100 g體質(zhì)量/日灌胃。

2.2 模型制作 分組完成后，第1周先普通飼養(yǎng)5 d，第2 周開始造模，喂以普通飼料。B、C、D、E 4 組大鼠每只第一次皮下注射40%CCl4橄欖油0.5 mL/100 g體質(zhì)量，A組大鼠則每只給予60%橄欖油生理鹽水0.5 mL/100 g體質(zhì)量皮下注射。以后B、C、D、E 4組大鼠每次每只皮下注射40%CCl4橄欖油0.3 mL/100 g體質(zhì)量，每周兩次。A組大鼠每只給予皮下注射60%橄欖油生理鹽水0.3 mL/100 g體質(zhì)量，每周兩次。造模組至第5周開始每周末隨機(jī)處死兩只大鼠觀察肝臟病理改變，到第9周發(fā)現(xiàn)匯管區(qū)纖維組織增生，并向肝組織內(nèi)延伸，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，未見假小葉形成，參照2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂標(biāo)準(zhǔn)［3］，肝纖維化形成，繼續(xù)按原方案注射CCl4維持大鼠肝纖維化程度，直到治療完畢。同時(shí)開始給各組大鼠按要求每天各自灌服相應(yīng)藥物，連續(xù)4周。在末次灌胃后3 d處死全部大鼠，取標(biāo)本供檢。

3 觀察內(nèi)容

3.1 一般情況 每次注射CCl4前稱體質(zhì)量1次，以調(diào)整用藥劑量。逐日觀察大鼠活動(dòng)、進(jìn)食量、毛色等情況，并記錄死亡數(shù)。

3.2 肝功能指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALB水平。

3.3 HA、PC-III、IV-C 采用放射免疫分析法測(cè)定，試劑盒由上海海軍醫(yī)學(xué)研究所提供，嚴(yán)格按照測(cè)定盒說明書方法操作。

3.4 TIMP－1采用免疫組化方法測(cè)定，試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，嚴(yán)格按照測(cè)定盒說明書方法操作。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型ALB的影響模型對(duì)照組ALB較空白對(duì)照組降低，各治療組ALB較模型對(duì)照組升高，各治療組內(nèi)部之間對(duì)ALB影響沒區(qū)別(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

表1 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型ALB的影響 (±s)

表1 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型ALB的影響 (±s)

注:與空白組對(duì)比，*P ＜0.05;與模型組對(duì)比，﹟ P ＜0.05。

組別 動(dòng)物/只 ALB/(g/L)10 36.9 ±1.79模型對(duì)照組 11 30.36 ±1.86*金水寶膠囊小劑量治療組 12 32.91±2.47*﹟金水寶膠囊中劑量治療組 12 33±2.80*﹟金水寶膠囊大劑量治療組 12 33.58±2.11*﹟空白對(duì)照組

4.2 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響 模型對(duì)照組HA較空白對(duì)照組明顯升高，但是各治療組與模型對(duì)照組相比HA均明顯降低，中、大劑量治療組較小劑量治療組HA降低更明顯(P＜0.05)，不過中劑量治療組和大劑量治療組之間對(duì)HA影響沒統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，治療后大劑量治療組HA與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。模型對(duì)照組PC-III較空白對(duì)照組明顯升高，但是中、大劑量治療組與模型對(duì)照組相比，PCIII明顯降低，小劑量治療組無明顯降低PC-III的作用。模型對(duì)照組Ⅳ-C較空白對(duì)照組明顯升高，但大劑量治療組Ⅳ-C較模型對(duì)照組明顯降低，治療后大劑量治療組Ⅳ-C與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響(±s)

表2 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響(±s)

注:與空白組對(duì)比，*P ＜0.05，□P ＞0.05;與模型組對(duì)比，﹟ P ＜0.05 ，△P ＞0.05。

組別 動(dòng)物/只 HA/(ng/mL) PC-III/(ng/mL) Ⅳ-C/(ng/mL)空白對(duì)照組10 138.68 ±18.47 43.85 ±3.11 84.37 ±7.67模型對(duì)照組 11 293.12 ±82.60* 59.63 ±8.24* 111.14 ±22.63*金水寶膠囊小劑量治療組 12 210.58±27.13*﹟ 53.998±7.89＊△ 118.39±29.75＊△金水寶膠囊中劑量治療組 12 174.55±41.46*﹟ 52.16±6.94*﹟ 99.85±30.86□△金水寶膠囊大劑量治療組 12 147.91±31.59□﹟ 51.19±7.06*﹟ 70.79±26.78□﹟

4.3 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型TIMP-1的影響 模型對(duì)照組TIMP-1較空白對(duì)照組明顯升高，但中、大劑量治療組TIMP-1較模型對(duì)照組明顯降低，且與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。大劑量治療組與中劑量治療組對(duì)TIMP-1的影響作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果見表3。

表3 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型TIMP-1的影響 (±s)

表3 金水寶膠囊對(duì)肝纖維化大鼠模型TIMP-1的影響 (±s)

注:與空白組對(duì)比，*P ＜0.05，□P ＞0.05;與模型組對(duì)比，﹟ P ＜0.05 ，△P ＞0.05。

組別 動(dòng)物/只 TIMP-1/(ng/mL)空白對(duì)照組10 24.35 ±4.04模型對(duì)照組 11 33.45 ±7.79*金水寶膠囊小劑量治療組 12 32.54 ±8.53＊△金水寶膠囊中劑量治療組 12 24.79 ±4.53□﹟金水寶膠囊大劑量治療組 12 24.21 ±5.44□﹟

5 討論

肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成、降解與沉積的不平衡，而引起的ECM過度沉積的病理過程，在這個(gè)過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)降解ECM，而TIMP-1可抑制MMP-1活性［4-5］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MMP-1與TIMP-1可有助于對(duì)肝纖維化的評(píng)價(jià)［6-7］，通過降低TIMP-1，可減少 MMP-1所受抑制，從而有利于ECM的降解，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

HA是由間質(zhì)細(xì)胞合成的一種大分子葡萄胺多糖，在肝臟主要是由肝星狀細(xì)胞合成，分布在各種結(jié)締組織中，是ECM的重要成分之一。血清PC-III含量可反映III型膠原的代謝和肝纖維化程度，血清IV-C也與肝纖維化有相關(guān)性。血清HA、PC-Ⅲ、Ⅳ-C可從不同的角度反映肝纖維化的情況，HA、PC-Ⅲ較敏感［8-9］。

金博等［10］發(fā)現(xiàn)人工蟲草菌絲可減少大鼠四氯化碳實(shí)驗(yàn)性肝纖維化肝內(nèi)膠原的沉積。李風(fēng)華等［11］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明冬蟲夏草菌絲有顯著的抗肝纖維化作用，其機(jī)制與促進(jìn)膠原降解有關(guān)。馬雄等［12］實(shí)驗(yàn)后認(rèn)為冬蟲夏草多糖脂體能明顯減少肝臟的膠原沉積，并能抑制I、III型前膠原基因的表達(dá)。

金水寶膠囊主要成分為蝙蝠蛾擬青霉Cs-4，是天然冬蟲夏草的替代品，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金水寶膠囊可升高四氯化碳實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠模型ALB，降低 TIMP-1、HA、PC-III、IV-C，具有較好的抗實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的作用。其可能的機(jī)理為通過抑制TIMP-1，減少對(duì)MMP-1降解ECM的干擾。因此，金水寶膠囊與天然冬蟲夏草同樣具有較好的抗肝纖維化的作用，有望應(yīng)用于臨床對(duì)肝纖維化的治療。

［1］程明亮，劉三都主編.肝纖維化的基礎(chǔ)研究和臨床［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996.

［2］袁盛榕主編.藥理學(xué)實(shí)習(xí)教程［M］.北京:世界圖書出版公司，1994:13.

［3］中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案［J］.中華傳染病雜志，2000，8:324-329.

［4］聶青和，周永興，謝玉梅.肝硬化病人血清、肝組織中金屬蛋白酶組織抑制因子的表達(dá)及意義［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81:805-807.

［5］Watanabe T，Niioka M，Hozawa S，et al.Gene expression of interstitial collagenase in both progressive and recovery phase of rat liver fibrosis induced by carbon tetrachloride［J］.Hepatol，2000，33:224-235.

［6］尹珊珊，李新民，王寶恩，等.血清膠原酶對(duì)判斷慢性乙型肝炎肝纖維化及炎癥程度的意義［J］.中華肝臟病雜志，2004，12:666-668.

［7］張健珍，龍英姿，李穗芬，等.慢性乙型肝炎血清MMP一1和TIMP—l與肝臟炎癥及肝纖維化的相關(guān)性［J］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2007;27:1520-1522.

［8］王先開，錢美寶.細(xì)胞外基質(zhì)成分與肝纖維化的關(guān)系［J］.肝臟，1999，(4):198-200.

［9］沈 菁，潘 敏，杜春桃.血清四項(xiàng)指標(biāo)在肝纖維化診斷中的意義［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005(5):728-729.

［10］金 博，廖 丹，孫 濤，等.人工蟲草菌絲及鋅減少肝纖維化大鼠肝臟膠原的沉積［J］.天津醫(yī)藥，2007，(10):761.

［11］李風(fēng)華，劉 平，熊衛(wèi)國(guó)，等.冬蟲夏草菌絲對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2006，(5):514.

［12］馬 雄，邱德凱，徐 軍，等.冬蟲夏草多糖脂質(zhì)體抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，(9):28.