天山雪蓮凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃賢慧， 邢建國(guó)， 王新春，， 袁 勇， 陳衛(wèi)軍

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832002;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004;3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008)

天山雪蓮凝膠劑由天山雪蓮單味藥材制成的維藥新制劑，具有補(bǔ)腎活血，強(qiáng)筋骨，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，調(diào)節(jié)異常體液等功效［1］，是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)疼痛的有效藥物［2-3］。綠原酸和蘆丁是天山雪蓮中主要藥效成分［4-5］。為有效控制制劑質(zhì)量，本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定天山雪蓮凝膠劑中綠原酸和蘆丁的高效液相色譜法和鑒別天山雪蓮凝膠劑中綠原酸和蘆丁的薄層色譜法，結(jié)果所建立的方法準(zhǔn)確、可靠、專(zhuān)屬性強(qiáng)，能有效控制天山雪蓮凝膠劑的質(zhì)量，為天山雪蓮凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀(LC-20AT二元高壓泵，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器);pH酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);NDJ-1旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);AE-200電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);Millipore simplicity-185超純水器(美國(guó)密理博公司)。綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-200413)，蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100080-200707)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。甲醇、乙腈為色譜純(SK Chemicals公司)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。天山雪蓮凝膠劑由石河子大學(xué)藥學(xué)院制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品為棕黃色半固體，均勻且細(xì)膩，稠度適宜，涂展性好。

2.2 檢查

2.2.1 pH值 稱(chēng)取凝膠劑約1.0 g，用10 g蒸餾水稀釋?zhuān)谑覝叵聹y(cè)定 pH，范圍為5.5 ～6.5。

2.2.2 黏度 采用NDJ-1旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)(1號(hào)轉(zhuǎn)子、12 r/min)室溫測(cè)定，結(jié)果為(183±6)MPa·s。

2.2.3 其他 應(yīng)符合凝膠劑項(xiàng)下的有關(guān)各項(xiàng)規(guī)定(《中國(guó)藥典》2010版一部附錄IQ)。

2.3 定性鑒別［6］取本品約0.25 g，置10 mL量瓶中，加甲醇10 mL，超聲5 min，離心，取上清液作為供試品溶液。同法處理空白凝膠，作為陰性對(duì)照溶液。另取天山雪蓮藥材約1.0 g，加入70%乙醇50 mL，回流提取1 h，離心，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。再分別取綠原酸、蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.5 mg綠原酸和0.5 mg蘆丁的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)［2］，分別吸取上述5種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶2)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以0.1%亞硝酸鈉的1%甲醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 天山雪蓮TLC鑒別

2.4 定量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱:Waters ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.4% 磷酸(B)，0 ～ 13 min 12%(A)，13 ～16 min 12%(A)-15%(A)，16 ～40 min 15%(A);檢測(cè)波長(zhǎng):353 nm;體積流量:1 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10 μL。在此色譜條件下，供試品中綠原酸及蘆丁的保留時(shí)間為 8.2 min和 31.2 min，理論塔板數(shù)依次為 4000、9000。色譜峰達(dá)到完全分離，綠原酸及蘆丁與相鄰峰的分離度均大于2且峰形對(duì)稱(chēng)，綠原酸及蘆丁的對(duì)稱(chēng)因子分別為1.17 和 1.13。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密稱(chēng)取綠原酸、蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇溶解，定容，所得綠原酸、蘆丁的質(zhì)量濃度分別是 0.48 mg/mL、0.65 mg/mL，作為對(duì)照品貯備液;再分別精密吸取綠原酸、蘆丁對(duì)照品貯備液各2.5 mL至25 mL棕色量瓶，甲醇定容，配成綠原酸、蘆丁的質(zhì)量濃度分別為48.0 μg/mL、65.0 μg/mL混合對(duì)照品貯備液。精密吸取混合對(duì)照品貯備液 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 mL 至 10 mL 棕色量瓶，甲醇定容，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品，以峰面積A為縱坐標(biāo)，綠原酸、蘆丁質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。綠原酸回歸方程為:A=12010C，r=0.9998，其質(zhì)量濃度在 2.4 ～48.0 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;蘆丁回歸方程為:A=18256C，r=0.9997，其質(zhì)量濃度在 3.25 ～ 65.0 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，且標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)，因此可采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量測(cè)定。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品約0.05 g，精密稱(chēng)定，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇約15 mL，超聲5 min，放置至室溫，定容，取1.0 mL提取液至5 mL棕色量瓶中，甲醇定容，搖勻，離心10 min，取其上清液過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4.4 空白干擾試驗(yàn) 按處方中各成分比例，制備不含天山雪蓮的空白凝膠，按“供試品溶液制備”方法制備空白溶液，依法測(cè)定，結(jié)果無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定供試品溶液中綠原酸及蘆丁峰面積值，結(jié)果供試品綠原酸峰面積值RSD為0.58%;蘆丁峰面積值RSD為0.40%。

圖2 天山雪蓮凝膠HPLC圖

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件，每隔2 h測(cè)定供試品溶液中綠原酸及蘆丁峰面積值，共測(cè)定6次，結(jié)果供試品綠原酸峰面積值RSD為1.24%;蘆丁峰面積值RSD為1.06%。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取本品6份，各約0.05 g，精密稱(chēng)定，照2.4.3項(xiàng)供試品溶液的制備項(xiàng)處理，按2.4.1項(xiàng)測(cè)定項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果綠原酸峰面積值RSD為1.75%;蘆丁峰面積值RSD為1.93%。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別取供試品凝膠6份，每份約0.025 g(含綠原酸約 0.8355 mg，含蘆丁約 1.669 mg)，精密稱(chēng)定，分別置50 mL量瓶中，各精密加入混合對(duì)照品溶液，按照2.4.3項(xiàng)供試品溶液的制備項(xiàng)處理，離心10 min，取其上清液，過(guò)0.22 μm后，按2.4.1項(xiàng)測(cè)定項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算綠原酸平均回收率為101.18%，RSD為0.57%(n=6);蘆丁平均回收率為 102.12%，RSD 為 1.41%(n=6)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 綠原酸及蘆丁回收率測(cè)定(n=6)

2.4.9 樣品測(cè)定 分別按照2.4.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定3批樣品。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 在建立檢測(cè)天山雪蓮凝膠劑樣品中的綠原酸和蘆丁的HPLC色譜條件時(shí)，參考相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)法進(jìn)行考察，即在327 nm處檢測(cè)綠原酸，257 nm處檢測(cè)蘆丁。結(jié)果，通過(guò)提取色譜圖發(fā)現(xiàn)，雙波長(zhǎng)檢測(cè)法所得綠原酸和蘆丁的峰形及分離度均不理想。另參考中國(guó)藥典2010年版和相關(guān)文獻(xiàn)［9-10］，檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm。通過(guò)提取色譜圖發(fā)現(xiàn)，綠原酸的分離度達(dá)不到要求，且蘆丁的峰形對(duì)稱(chēng)性不理想。因此，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)全波段掃描結(jié)果(綠原酸最大吸收波長(zhǎng)為325 nm，蘆丁最大吸收波長(zhǎng)分別為254 nm及353 nm)，在檢測(cè)波長(zhǎng)為353 nm，所得綠原酸和蘆丁色譜圖的峰形與分離度均達(dá)到要求。

3.2 在建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定天山雪蓮凝膠劑中綠原酸和蘆丁色譜條件時(shí)，流動(dòng)相的選擇參考文獻(xiàn)［11-12］，采用了甲醇-磷酸、乙腈-磷酸系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果乙腈(A)-0.4%磷酸(B)，0～13 min 12%(A)，13～16 min 12%(A)～15%(A)，16～40 min 15%(A)時(shí)，綠原酸和蘆丁的峰形均對(duì)稱(chēng)，分離完全，陰性樣品無(wú)干擾。方法準(zhǔn)確、靈敏、快速、重現(xiàn)性好，可作為該制劑的含量控制方法。

3.3 經(jīng)3批樣品中綠原酸和蘆丁測(cè)定，綠原酸質(zhì)量濃度在16.60～16.81 mg/mL，蘆丁質(zhì)量濃度在 33.03 ～33.73 mg/mL，因此考慮到實(shí)際生產(chǎn)中天山雪蓮藥材的來(lái)源，以及提取、純化過(guò)程、儲(chǔ)藏環(huán)境等因素對(duì)含量的影響，故暫定本品:每克含綠原酸不得少于13.37 mg;每克含蘆丁不得少于26.70 mg。

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