萊菔子飲片中蘿卜苷測(cè)定方法的研究

呂文海， 任 濤， 孟祥紅， 蘇永汶

萊菔子是具“生熟異治”、“生升熟降”藥性特點(diǎn)的常用中藥，炒后長(zhǎng)于消食除脹、降氣化痰［1］。經(jīng)系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)萊菔子生、炒品中氣味和揮發(fā)性部位存有明顯的質(zhì)變與量變成分，但兩者含量很微［2］。在水溶性部位中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定了兩個(gè)含硫新化合物A209與B221，HPLC含測(cè)證明，二者主要存在于生萊菔子中，炒制后A209量顯著降低，B221未檢測(cè)到。A209 系 S-6-甲亞砜基甲基-1，3-噻嗪烷-2-硫酮，S-6-(methylsulfinyl)methyl-1，3-thiazinane-2-thione，CCDC號(hào):742902;B221為 N-(E)-(4-甲亞砜基-3-丁烯基)胺基硫代甲酸乙酯，O-ethyl N-(E)-4(methylsulfinyl)but-3-enylcarba mothioate，CCDC 號(hào):742907［3］。萊菔子生、炒品成分群 HPLC圖譜分析表明A209與B221是化合物C3在不同條件下的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，進(jìn)一步證明C3為萊菔子素，萊菔子素是硫代葡萄糖苷類成分蘿卜苷的酶解產(chǎn)物［4-5］。在尚未分離到蘿卜苷對(duì)照品的情況下，以烯丙基硫苷為內(nèi)標(biāo)物，以HPLC圖譜中萊菔子硫苷與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為指標(biāo)，比較不同炮制品中的硫苷相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)并用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選炮制工藝，證明炒萊菔子有利于硫苷類成分的保存［6］。

基于上述工作，本實(shí)驗(yàn)建立了萊菔子水煎劑中蘿卜苷的HPLC測(cè)定方法，并證明了該方法在反映萊菔子生、制品特征方面的專屬性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 供試飲片

萊菔子購(gòu)于鄄城良海中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系周鳳琴教授鑒定為十字花科植物蘿卜Raphanus sativus L．的干燥成熟種子，符合《中國(guó)藥典》(2010年版)藥用規(guī)定。按確定的凈制工藝凈選后作生萊菔子樣品。

炒萊菔子 按參考文獻(xiàn)［6］確定的工藝參數(shù)炒至質(zhì)地鼓起，易脫皮，富油性并有爆裂聲和特有香氣溢出時(shí)，取出，晾涼。

萊菔子炒過(guò)品 在炒品的基礎(chǔ)之上繼續(xù)炒制，炒至顏色加深、表面焦糊時(shí)，取出，晾涼備用。

上述供試飲片，粉碎成粗粉，置干燥器內(nèi)平衡水分后備用。

1．2 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);SB2200超聲波清洗機(jī)(上海必能信超聲有限公司)。

乙腈為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)，其他試劑為分析純。

1．3 蘿卜苷對(duì)照品 自制。為淡黃色半固體油狀物，易溶于水，微溶于甲醇等極性較大的有機(jī)試劑。經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR 檢測(cè)，相關(guān)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］對(duì)照，確定為蘿卜苷。HPLC面積歸一化法測(cè)定其純度大于92%。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex-C18(4．6mm×250 mm，5μm);以乙腈-0．1%的磷酸水溶液(5∶95)為流動(dòng)相;設(shè)定體積流量1．0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL;經(jīng)蘿卜苷全波長(zhǎng)掃描(見(jiàn)圖1)，以225 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，360 nm為參比波長(zhǎng)。

圖1 蘿卜苷紫外吸收光譜圖Fig．1 UV spectra of glucoraphenin

2．2 供試品溶液的制備 根據(jù)蘿卜苷的溶解性，按照中醫(yī)主用湯劑入藥的實(shí)際，采用水回流提取制備萊菔子供試樣品:取供試品粉末0．1 g，精密稱定。置50 mL燒瓶中，精密加水25 mL，浸泡30 min，稱定質(zhì)量?；亓魈崛?．0 h，補(bǔ)足損失質(zhì)量，抽濾，濾液經(jīng)0．45μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

2．3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘿卜苷對(duì)照品0．007 55 g，純凈水溶解，定容至10 mL。依次稀釋配制成質(zhì)量濃度為 0．755、0．604、0．453、0．302、0．151、0．075 5、0．037 8 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2．4 蘿卜苷HPLC檢測(cè)方法學(xué)考察

2．4．1 線性關(guān)系考察 用2．3項(xiàng)中的對(duì)照品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)蘿卜苷質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=12 428X+38．398(r=0．999 8)。實(shí)驗(yàn)表明蘿卜苷質(zhì)量濃度在0．755～0．037 8 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2．4．2 精密度實(shí)驗(yàn) 取2．3項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0．302 mg/mL的蘿卜苷對(duì)照品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定蘿卜苷的峰面積為:3 729．8、3 746．8、3 760．4、3 772．3、3 789．8，平均值為3 758．8，RSD 為0．61%，表明儀器精密度良好。

2．4．3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按2．2項(xiàng)下方法制備炒萊菔子供試品溶液，分別于 0、0．5、1、2、4、6、8 h 時(shí)按 2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)蘿卜苷的峰面積計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)，分別為:8．13%、8．08%、8．11%、8．13%、8．12%、8．20%、8．13%，平均值為 8．13%，RSD為0．44%，表明供試品溶液在制備后8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．4．4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 按2．2項(xiàng)下方法平行制備炒萊菔子供試品溶液5份，按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)蘿卜苷的峰面積計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為:8．08%、7．78%、8．02%、8．21%、8．05%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8．03%，RSD=1．96%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2．4．5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取5份已知量的炒萊菔子樣品各0．1 g，用減重法加入與待測(cè)樣品蘿卜苷量近似的蘿卜苷對(duì)照品，按樣品測(cè)定方法處理，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)表明本方法回收率符合測(cè)定要求。

表1 炒萊菔子供試品加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 Results of plus samp le Recovery in Raphani Semen

2．5 萊菔子不同炮制品中蘿卜苷的測(cè)定 分別取萊菔子生、炒、炒過(guò)品各0．1 g，精密稱定。按2．2項(xiàng)下要求制備供試品溶液，并按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)表明，萊菔子炒品中蘿卜苷是生品的8．55倍，如炒過(guò)則蘿卜苷損失殆盡。實(shí)驗(yàn)證明蘿卜苷量可以客觀反映萊菔子的炮制程度，具有質(zhì)量控制上的專屬性。HPLC圖見(jiàn)圖2。

表2 萊菔子不同炮制品中蘿卜苷測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab．2 Determ ination of glucoraphenin in different processed Raphani Semen(n=3)

圖2 萊菔子不同炒制品圖譜Fig．2 Spectra of different roasted Raphani Semen

3 小結(jié)與討論

建立能反映中藥炮制過(guò)程中相關(guān)成分變化，控制飲片炮制程度的專屬性質(zhì)控方法，是中藥炮制機(jī)理研究的重要內(nèi)容，是使飲片炮制規(guī)范化的關(guān)鍵技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)首次從炒萊菔子中分離純化了其所含硫苷類化合物的主成分蘿卜苷，并建立了萊菔子水提液中蘿卜苷的HPLC測(cè)定方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在萊菔子炒制達(dá)到優(yōu)選工藝中形、色、氣、味、質(zhì)要求的前提下，其水煎劑中蘿卜苷量是生萊菔子的8．55倍，如炒過(guò)，蘿卜苷則無(wú)法檢出。結(jié)合炮制品性狀要求，蘿卜苷定量測(cè)定可作為有效反映萊菔子炮制程度的專屬性質(zhì)量控制方法。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，萊菔子如僅微炒，在達(dá)不到傳統(tǒng)要求的形體鼓起，種皮易捻脫，富含油性，具濃郁特殊香氣等性狀要求時(shí)，蘿卜苷的量要高于優(yōu)選工藝炮制品。但中藥飲片是為中醫(yī)臨床服務(wù)的，炮制中特有的“火候”要求，是在長(zhǎng)期臨床驗(yàn)證中形成的，在飲片入藥的形式下，飲片的特有性狀要求必須得到充分的繼承。否則，僅以蘿卜苷量為標(biāo)準(zhǔn)，獲得的將是臨床不認(rèn)可的炒萊菔子，性狀與蘿卜苷定量測(cè)定相結(jié)合的方法，可以更客觀有效地保證萊菔子的炮制質(zhì)量。這在中藥炮制機(jī)理和質(zhì)量控制方法研究中必須引起足夠的重視。

［1］龔千鋒．中藥炮制學(xué)［M］．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2005:109．

［2］張 欣，王愛(ài)武，宿廷敏，等．萊菔子生制品揮發(fā)性成分GC-MS分析［J］．中成藥，2008，30(1):96-98．

［3］Zhang Xin，Liu Hongbing，Jia Jingjing，et al．Two novel sulfur compounds from the seeds of Raphanus sativus L．［J］．J Asian Nat Prod Res，2010，12(2):113-118．

［4］任 濤，呂文海，張 欣，等．萊菔子炮制前后成分群變化的初步研究［J］．中成藥，2009，31(11):1715-1718．

［5］呂文海，任 濤，蘇永汶，等．炮制抑制萊菔子中蘿卜苷酶解轉(zhuǎn)化的初步研究［J］．中國(guó)中藥雜志，2011，36(8):980-983．

［6］任 濤，呂文海．以硫代葡萄糖苷相對(duì)含量?jī)?yōu)選萊菔子炮制工藝研究［J］．中成藥，2010，32(7):1159-1162．

［7］Iori R，Barillari J，Gallienne E，et al．Thio-functionalised glucosinolates:unexpected transformation of desulfoglucoraphenin［J］．Tetrahedron Lett，2008，49:292-295．