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    L-亮氨酸-U-13C6 的研制

    2011-07-18 01:25:42杜曉寧李良君
    同位素 2011年1期
    關(guān)鍵詞:亮氨酸產(chǎn)酸氮源

    張 亮,杜曉寧,李良君

    (上?;ぱ芯吭?上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心,上海 200062)

    隨著后基因組計(jì)劃的到來,蛋白質(zhì)組研究成為生命科學(xué)的最前沿。在用核磁共振(NMR)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及定量蛋白質(zhì)組學(xué)方面,13C標(biāo)記的氨基酸和蛋白質(zhì)都大有用武之地,已成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域不可或缺的重要工具[1]。13C標(biāo)記L-亮氨酸產(chǎn)品在醫(yī)藥工業(yè)、生命科學(xué)、食品工業(yè)、分析測試等相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,特別是在醫(yī)療領(lǐng)域,其作用越來越突出。近年來,國內(nèi)一些大醫(yī)院也已開始利用13C標(biāo)記L-亮氨酸對(duì)多種疾病進(jìn)行診斷、治療。如:北京協(xié)和醫(yī)院利用13C標(biāo)記的L-亮氨酸進(jìn)行呼氣實(shí)驗(yàn)[2],以判斷氨基酸在腸道內(nèi)的吸收是否異常,是否患有蛋白質(zhì)吸收不良癥;還可以通過給予口服氨基酸判斷進(jìn)行營養(yǎng)學(xué)治療的可能性。天津第二醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院以13C標(biāo)記亮氨酸作為示蹤劑跟蹤蛋白質(zhì)代謝是否異常,以此作為判斷癌癥的依據(jù)之一[3]。利用13C標(biāo)記亮氨酸進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究更是不勝枚舉,如手術(shù)前后采用靜脈輸入13C標(biāo)記亮氨酸的方法進(jìn)行蛋白動(dòng)力學(xué)研究[4],以亮氨酸-13C作為示蹤劑測定兔子燒傷后整體蛋白代謝水平的改變[5]等。而這些13C標(biāo)記L-亮氨酸試劑均從國外進(jìn)口,昂貴價(jià)格。本工作擬通過生物發(fā)酵法,自行研制L-亮氨酸-U-13C6。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器設(shè)備

    SCS-24型巡回式自動(dòng)搖瓶機(jī):上海市離心機(jī)械研究所提供;LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋:上海醫(yī)用核子儀器廠提供。

    1.2 主要試劑

    13C標(biāo)記葡萄糖:上?;ぱ芯吭鹤灾疲黄咸烟牵篈R級(jí),中國醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;H+型732陽離子交換樹脂:上海樹脂廠。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 培養(yǎng)基配方(g/L)

    活化斜面培養(yǎng)基:葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5 g/L、瓊脂條20g/L、pH7.0~7.2。在121℃下滅菌20min。

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏 5g/L、NaCl 2.5g/L、pH 7.0~7.2。在121℃下滅菌20min。

    2.2 誘變選育

    2.2.1 紫外誘變

    取1環(huán)菌體,接種于液體完全培養(yǎng)基,在28℃下振蕩(100r/min)培養(yǎng)9~10h。用滅完菌的移液器取1mL培養(yǎng)液,用無菌生理鹽水稀釋10倍后均勻涂布于保藏平板上,放入紫外照射箱進(jìn)行誘變,誘變時(shí)間為30~100s。

    2.2.2 DES誘變

    取1環(huán)菌體,接種于種子培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)6h,取10mL菌液,離心、去上清夜,菌體用磷酸緩沖液洗滌2次,之后加入一定量磷酸緩沖液配成菌液。向菌液中加入0.2mL DES誘變劑,攪拌誘變30min。用硫代硫酸鈉溶液終止誘變。

    2.2.3 紫外與DES復(fù)合誘變

    將DES誘變完的菌體再進(jìn)行紫外誘變,誘變條件與2.2.1節(jié)及2.2.2節(jié)相同。

    2.2.4 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選

    根據(jù)育種目標(biāo),本工作要選出“Met-+I(xiàn)le-”突變株,即挑選僅能在添加蛋氨酸和異亮氨酸的平板上生長的突變株[6,7]。

    2.2.5 抗性菌株的篩選

    選育抗性突變株,可以解除亮氨酸合成途徑上關(guān)鍵酶及限速酶的反饋抑制及反饋?zhàn)瓒糇饔?,進(jìn)一步提高產(chǎn)酸累積量。通過在活化培養(yǎng)基中加入不同濃度不同種類的抗性藥物制成抗性藥物平板,將誘變后的突變株接入其中,挑選能夠在高抗性藥物濃度下生長的菌株。

    2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

    2.3.1 種子液培養(yǎng)[8]

    取1環(huán)活化后的菌體接入裝有25mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,9層紗布封口,30℃下,于巡回式搖瓶柜中培養(yǎng)15h,振搖速度為200r/min。

    2.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)[9]

    用移液槍取3mL上述培養(yǎng)好的種子液接入裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,9層紗布封口,28℃下于巡回式搖瓶柜中培養(yǎng),振搖速度為200r/min。培養(yǎng)期間定其檢測殘?zhí)?,?dāng)殘?zhí)窍陆档?%以下時(shí),發(fā)酵反應(yīng)停止。

    2.4 提取方法

    采用離子交換(732陽離子樹脂)法進(jìn)行分離,通過氯化銨、氨水兩步洗脫法進(jìn)行分離[10]。

    2.5 分析方法

    采用氨基酸自動(dòng)分析儀[11]測定發(fā)酵液產(chǎn)酸量;采用凱氏定氮法測定L-亮氨酸純度;采用同位素質(zhì)譜儀測定13C豐度。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 目的突變株TS151的誘變選育[12]

    育種譜圖中各菌株的氨基酸積累情況列于表1。由表1可以看出,通過數(shù)次誘變選育,出發(fā)菌株ACTT39106逐漸帶上蛋氨酸缺陷(Met- )、異 亮 氨 酸 缺 陷 (Ile- )和 帶 磺 胺 胍(SGr)、α-氨基丁酸(α-ABr)、β-羥基亮氨酸(β-HLr)抗性標(biāo)記等5種遺傳標(biāo)記,產(chǎn)酸也從原來的幾乎沒有提高到18.2g/L,滿足了高豐度生產(chǎn)的需求。

    3.2 目的突變株TS151的遺傳穩(wěn)定性檢測

    將高產(chǎn)菌株TS139和TS151在完全液體培養(yǎng)基上連續(xù)搖瓶培養(yǎng)10代。取第10代菌液用平板劃線分離單菌落后轉(zhuǎn)接斜面[13]。取斜面培養(yǎng)物制成經(jīng)離心洗滌過的菌懸液。用濾紙片法驗(yàn)證缺陷型標(biāo)記[14];各取0.2mL菌液均勻涂布在各個(gè)藥物平板表面。28℃恒溫培養(yǎng)72h,觀察濾紙片周圍和藥物平板上有無菌體生長及生長情況,結(jié)果列于表2。

    表2數(shù)據(jù)表明:TS139和TS151兩株菌仍為雙缺陷;TS139在8g/L磺胺胍抗性平板、8 g/Lα-氨基丁酸抗性平板上,TS151在8g/Lα-氨基丁酸抗性平板、4g/Lβ-羥基亮氨酸抗性平板上,均長出大小一致的小菌落。對(duì)每株菌隨機(jī)挑取5個(gè)菌落的少量菌體涂片,用革蘭氏染色,光鏡下檢查。結(jié)果顯示,菌體形態(tài)與原始菌株ATCC39106的一致。

    3.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

    3.3.1 發(fā)酵配方的優(yōu)化

    1)不同氮源對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以硫酸銨、醋酸銨、尿素、硝酸銨和氯化銨(以硫酸銨用量為4%時(shí)的含氮量0.85g來計(jì)算其它氮源的添加量)為氮源培養(yǎng)36h,觀察氮源對(duì)發(fā)酵的影響,結(jié)果列于表3。從表3可以看出,以醋酸銨為氮源時(shí)L-亮氨酸產(chǎn)量最高,其次為硫酸銨。醋酸銨在發(fā)酵中不僅起著氮源的作用,同時(shí)其醋酸根離子也參與了亮氨酸的合成代謝。

    表1 育種譜圖中各菌株的氨基酸積累情況

    表2 遺傳標(biāo)記穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

    表3 不同氮源對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    2)醋酸銨與硫酸銨配比對(duì)發(fā)酵的影響

    在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,醋酸銨與硫酸銨的配比對(duì)發(fā)酵的影響列于表4。從表4可以看出,表中所列各種配比,都能滿足菌體生長需要,但對(duì)產(chǎn)酸有不同的影響。當(dāng)有20g/L醋酸銨時(shí),添加20g/L硫酸銨,可以提高L-亮氨酸產(chǎn)量;只添加硫酸銨,含量即使高達(dá)40g/L,L-亮氨酸產(chǎn)量仍較低。

    表4 醋酸銨與硫酸銨配比對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    3)生物素對(duì)發(fā)酵的影響

    為了研究生物素用量對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響,實(shí)驗(yàn)在不添加玉米漿(玉米漿中含生物素)的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果示于圖1。由圖1可知,生物素對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響很顯著。生物素缺乏,菌體就不能生長;而當(dāng)生物素的質(zhì)量濃度提高到50~75μg/L時(shí),菌體生長良好,可獲得較高的L-亮氨酸產(chǎn)量。

    圖1 生物素對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    4)碳酸鈣用量對(duì)發(fā)酵的影響

    碳酸鈣用量對(duì)發(fā)酵的影響結(jié)果示于圖2。從圖2可知,碳酸鈣添加量為30g/L對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸最有利。

    3.3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

    1)溫度對(duì)發(fā)酵的影響

    圖2 碳酸鈣用量對(duì)發(fā)酵的影響

    溫度對(duì)發(fā)酵的影響示于圖3。由圖3可知,在28~30℃時(shí),菌體生長好、菌體濃度大,L-亮氨酸產(chǎn)量較高,尤以28℃最好,發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)到最大值18.53g/L。溫度太低則菌體生長緩慢,難以完成對(duì)原料的轉(zhuǎn)化;溫度太高,菌體易衰老,菌體后勁不足,不利于高產(chǎn)L-亮氨酸。從圖3數(shù)據(jù)來看,L-亮氨酸發(fā)酵溫度控制在28℃為佳,最高不宜超過30℃。

    2)裝液量對(duì)發(fā)酵的影響

    采用優(yōu)化的培養(yǎng)基和相同的種子及接種比例,在同一搖床上,選擇培養(yǎng)溫度為28℃,在220r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)92h,考查250和500mL兩種規(guī)格圓底三角瓶的不同裝液量對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響,結(jié)果分別示于圖4和圖5。

    圖3 溫度對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    圖4 250mL三角瓶裝液量對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    圖5 500mL三角瓶裝液量對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    分析圖4和圖5可知,對(duì)相同規(guī)格三角瓶而言,由于固定了搖床轉(zhuǎn)速,若裝液量太少,在往復(fù)振蕩時(shí)發(fā)酵液翻滾過于劇烈,使溶氧過大而導(dǎo)致產(chǎn)酸不高。而裝液量過大則發(fā)酵液不易翻滾,使溶氧太少,導(dǎo)致產(chǎn)酸也不高。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,500mL三角瓶裝液50mL或250mL三角瓶裝液25mL為佳。

    3)pH對(duì)發(fā)酵的影響

    在接種前用滅菌的5mol/L NaOH溶液重調(diào)發(fā)酵液pH,并在發(fā)酵過程中每隔4h調(diào)pH至所需值(±0.1)。實(shí)驗(yàn)在同一搖床上進(jìn)行,發(fā)酵92h結(jié)束,結(jié)果示于圖6。由圖6得知,在發(fā)酵過程中控制pH7.0,有利于菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸。實(shí)驗(yàn)中觀測到,pH對(duì)發(fā)酵前期的菌體生長和中、后期發(fā)酵產(chǎn)酸影響都較大。pH7.0時(shí)菌體生長較快,培養(yǎng)至36~38h即結(jié)束對(duì)數(shù)生長進(jìn)入穩(wěn)定期。因此,發(fā)酵過程控制pH7.0,有利于菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸。

    圖6 pH對(duì)L-亮氨酸發(fā)酵的影響

    3.4 同位素13C高豐度實(shí)驗(yàn)

    將黃色短桿菌TS151從斜面接種于種子培養(yǎng)基中,每瓶接1環(huán)菌體,共接2瓶,置于搖床上,在28℃、220r/min下震蕩培養(yǎng)20h。在無菌條件下按10%接種量將新鮮種子液接入發(fā)酵培養(yǎng) 基 中 (原 料 葡 萄 糖-13C 豐 度 為 99%),500mL三角瓶裝液量50mL,置于巡回式搖床上,在28℃、220r/min下培養(yǎng)92h,直到發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵平均產(chǎn)酸16.6g/L。

    將上述發(fā)酵液合并后用草酸調(diào)節(jié)pH至2~3,經(jīng)離心分離(4 800r/min,30min),所得到的上清液用陽離子交換樹脂(H+型)吸附。先用蒸餾水洗至中性,然后用0.2mol/L氯化銨溶液進(jìn)行洗脫,收集L-亮氨酸-U-13C6單斑洗脫液;將上述洗脫液調(diào)pH至2.0后上陽離子交換樹脂(H+型)脫鹽;收集L-亮氨酸-U-13C6單斑洗脫液,放入活性炭脫色、結(jié)晶。真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6產(chǎn)品,產(chǎn)品豐度達(dá)97.03%,純度98.5%,提取收率71.31%。

    4 小 結(jié)

    1)本研究以代謝控制發(fā)酵原理為基礎(chǔ),選育獲得突變株黃色短桿菌TS151(帶有5種遺傳標(biāo)記:Met-、Ile-、SGr、а-ABr、β-HLr),斜面連續(xù)轉(zhuǎn)接10次,遺傳標(biāo)記穩(wěn)定,高豐度產(chǎn)酸穩(wěn)定在15g/L以上,空白產(chǎn)酸穩(wěn)定在20g/L以上。

    2)優(yōu)化了L-亮氨酸-U-13C6生產(chǎn)的發(fā)酵配方和發(fā)酵工藝,通過高豐度實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)選育菌株TS151可應(yīng)用于L-亮氨酸-U-13C6的生產(chǎn)。

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