消旋丁苯肽對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響*

王義義 許 靜 楊 卓

血管性癡呆（VD）是腦血流減少引起的腦組織損傷所導(dǎo)致的進(jìn)行性記憶以及認(rèn)知功能的損傷。在英美國家中，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病（AD）[1]。VD表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知功能下降，影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也給監(jiān)護(hù)人帶來困難。消旋丁苯肽（dl-NBP）是從天竺葵屬植物芹菜籽中提取的成分，dl-NBP包括左旋丁苯肽和右旋丁苯肽，主要用于中風(fēng)的治療。在治療卒中的研究中發(fā)現(xiàn)dl-NBP可改善微循環(huán)[2]并減少神經(jīng)元的凋亡[3]。以上作用機(jī)制也是參與VD疾病中神經(jīng)元損傷的機(jī)制[4]。本研究旨在評(píng)價(jià)dl-NBP對(duì)VD的認(rèn)知障礙是否有改善作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 成年雄性健康清潔級(jí)Wistar大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為對(duì)照組、VD組和VD給予dl-NBP干預(yù)（VD+dl-NBP）組，每組10只。

1.2 動(dòng)物模型制造 實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎（2VO）結(jié)合高脂喂養(yǎng)的方法造模。首先對(duì)VD組和VD+dl-NBP組大鼠進(jìn)行高脂飼料（購自天津市利居生物用品有限公司）喂養(yǎng)3周，然后進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎手術(shù)。使用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，頸部皮膚備皮，碘伏消毒后沿中線切開約1.5 cm的切口，找到并游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎。70%乙醇消毒后縫合傷口，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)，自由攝食水。對(duì)照組大鼠僅手術(shù)切開頸部皮膚和皮下組織后便縫合，放回籠中飼養(yǎng)。VD+dl-NBP組大鼠手術(shù)后當(dāng)天開始給予dl-NBP（40 mg/kg）灌胃，1次/d，共30 d。

1.3 Morris水迷宮（MWM）實(shí)驗(yàn) 造模后第30天進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)，用于評(píng)價(jià)大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的能力。實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括一個(gè)圓形的水池，充滿水（約60 cm深）并用墨汁將水染黑。水池以假想的十字線分為4個(gè)象限，分別以1、2、3、4代表。將一個(gè)直徑10 cm的平臺(tái)置于水面下1.5 cm。MWM實(shí)驗(yàn)分為2部分：定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天分上、下午兩段，上下午各訓(xùn)練4次，從4個(gè)象限分別放大鼠入水。平臺(tái)放在第二象限。共訓(xùn)練8次。記錄大鼠爬上平臺(tái)所需時(shí)間（逃避潛伏期，escape latency）。如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引至平臺(tái)，并保持5 s，潛伏期記為60 s。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，水池周圍參照物位置不變?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)用于觀察大鼠對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的能力。即在實(shí)驗(yàn)的第6天撤除平臺(tái)，將大鼠放入水中，測(cè)其在60 s內(nèi)在原平臺(tái)象限搜索時(shí)間占總游泳時(shí)間（60 s）的百分比。

1.4 記錄海馬區(qū)CA3-CA1長時(shí)程增強(qiáng)（LTP） 在MWM結(jié)束后當(dāng)天，大鼠經(jīng)30%烏拉坦（4 mL/kg）麻醉后，進(jìn)行LTP記錄。首先將頭固定于頭顱立體定位儀（Narishinge，Japan）。在大鼠頭頂部切開大約1.5 cm切口，暴露顱骨。定位刺激電極和記錄電極的位置，刺激電極位置在前囟后4.2 mm,中線旁3.5 mm；記錄電極在前囟后3.5 mm，中線旁2.5 mm。在電極位于顱骨的投影處將顱骨打開，掀去硬腦膜，將刺激電極和記錄電極輕輕插入左側(cè)海馬，電極深度根據(jù)生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)確定[5]。在scope軟件中記錄場(chǎng)興奮性突觸后電位（fEPSP）。20 min基礎(chǔ)的fEPSP記錄后，給予高頻刺激（HFS，10 Hz的串刺激，脈沖組數(shù)為10，主周期為2 s，重復(fù)次數(shù)為10）。然后再記錄60 min。以基礎(chǔ)fEPSP后5 min的斜率為基值，以HFS誘導(dǎo)后50～60 min的fEPSP的斜率除以基值來表示LTP的幅值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示。MWM中定位航行階段組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，其他數(shù)據(jù)3組比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 在前5 d的定位航行階段，3組大鼠的逃避潛伏期組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），不存在交互效應(yīng)（P>0.05）。VD組低于對(duì)照組和VD+dl-NBP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見表1。

表1 3組大鼠逃避潛伏期比較 （n=6，s±s）

表1 3組大鼠逃避潛伏期比較 （n=6，s±s）

F組內(nèi) =39.549，F(xiàn)組間=11.361，均P<0.01；F交互 =0.133，P>0.05

組別對(duì)照組（1）VD組（2）VD+dl-NBP組（3）第1天26.25±4.16 36.59±6.88 27.40±1.66第2天11.69±2.09 23.14±5.79 11.35±1.82第3天7.52±0.94 18.53±4.32 8.54±1.07 5.29±0.75 15.18±4.42 6.50±1.33組比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）P 0.001 0.672 0.001統(tǒng)計(jì)學(xué)處理5.84±0.89 15.04±2.73 7.99±1.17對(duì)照組（1）VD組（2）VD+dl-NBP組（3）組別 第4天 第5天

2.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 在第6天的測(cè)試階段，對(duì)照組、VD組及VD+dl-NBP組的目標(biāo)象限百分比分別為（51.1±2.87）%，（37.03±3.50）%，（54.42±3.06）%。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.03，P<0.01）。VD組低于對(duì)照組（P=0.02）和VD+dl-NBP組（P<0.001），見圖1。

2.2 3組長時(shí)程增強(qiáng)結(jié)果比較 由HFS誘發(fā)的長時(shí)程增強(qiáng)，箭頭所指為給予HFS的時(shí)點(diǎn)，見圖2a。對(duì)照組、VD組和VD+dl-NBP組的LTP幅值分別為（133.4±10.1）%、（108.4±16.9）%和（120.5±7.3）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=94.21，P<0.01）。VD組低于對(duì)照組和VD+dl-NBP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001），見圖2b。

3 討論

血管性癡呆是最常見的癡呆之一，缺血性血管疾病是引起VD的主要原因。VD的動(dòng)物模型最為常用的造模方法是血管閉塞方法，其中雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的方法操作簡單，有利于慢性病程的觀察[6]。在雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的基礎(chǔ)上給予高脂飼養(yǎng)，是一種改良的VD動(dòng)物模型，VD大鼠表現(xiàn)出的智能障礙和行為學(xué)改變更加明顯[7]。因此本研究使用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎結(jié)合高脂喂養(yǎng)的方法建立血管性癡呆模型。LTP是指突觸連接前后兩個(gè)神經(jīng)元之間信號(hào)傳遞的長時(shí)間的增強(qiáng)。是學(xué)習(xí)記憶的分子模型[8]。MWM是一種廣泛用于測(cè)定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[9]。MWM和LTP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VD組大鼠與對(duì)照組大鼠比較，逃避潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限百分比以及LTP均明顯下降，大鼠表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶能力的下降，提示造模成功。

目前用于治療VD的藥物有很多類，如膽堿酯酶抑制劑、腦細(xì)胞代謝賦活劑、鈣拮抗劑、麥角生物堿制劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、血管擴(kuò)張劑等[10]。但是還沒有滿意的預(yù)防以及治療VD的藥物。丁苯酞又名芹菜甲素，是從芹菜籽中分離出的有效成分，其有效機(jī)制涉及腦缺血病理的多個(gè)環(huán)節(jié),對(duì)缺血性卒中具有較強(qiáng)的治療作用。在MWM定位航行階段以及空間搜索階段的研究中，VD+dl-NBP組大鼠的逃避潛伏期以及目標(biāo)象限百分比，與VD組大鼠比較都有非常明顯的改善，提示dl-NBP具有改善VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的作用。在電生理實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)顯示VD+dl-NBP組大鼠的LTP較VD大鼠明顯提高，海馬LTP是學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)。因此提示dl-NBP具有改善VD大鼠的LTP，對(duì)于大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力起到提高的作用。

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