劉海玲,曹曉云
(天津市藥品檢驗所,天津 300070)
硫酸西索米星是由小單孢菌所產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,由于氨基糖苷類抗生素?zé)o特征紫外吸收,不能直接采用傳統(tǒng)HPLC-UV法測定,采用衍生化方法測定試驗結(jié)果影響因素多,無法明確判斷檢測到的雜質(zhì)來源,限制了衍生化法在氨基糖苷類抗生素有關(guān)物質(zhì)檢測方面的應(yīng)用。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)為不含發(fā)色團(tuán)化合物的分析提供了一種新的檢測手段,其響應(yīng)值與被測物質(zhì)量成正比,不依賴于被測物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)[1]。近年來陸續(xù)有文獻(xiàn)報道用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量分析[2-5]?!度站址健返?5改正版采用TLC法檢查硫酸西索米星有關(guān)物質(zhì),其余各國藥典均未制定硫酸西索米星有關(guān)物質(zhì)檢查項。本實驗采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法[6]對硫酸西索米星進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查,方法靈敏度高、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好,可滿足質(zhì)量控制要求。
島津LC-10AT高效液相色譜儀,Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器。西索米星標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所提供,批號0353-200001);硫酸西索米星為江蘇無錫山禾福祁制藥有限公司(批號20070801、20071001和20071002)和江蘇無錫第二制藥廠(批號20070503)提供。試驗用水為娃哈哈飲用純凈水;三氟乙酸為TEDIA公司產(chǎn)品。
2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱:CAPCELL PAK TYPE:ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相:0.3 mol/L三氟乙酸-甲醇-乙腈(96∶3∶1);流速:0.5 ml/min;蒸發(fā)光散射檢測器,漂移管溫度:110 ℃,霧化氣體流速:3.0 L/min。
系統(tǒng)適用性試驗:分別稱取慶大霉素C1a和西索米星對照品適量,用水溶解并稀釋制成每1 ml中含慶大霉素C1a0.1 mg和西索米星3 mg的溶液,作為分離度測試溶液①;稱取西索米星對照品約50 mg,加0.5 ml過氧化氫溶液(濃過氧化氫溶液10→100)溶解,水浴45 min后立即取出,放冷至室溫,加水稀釋至10 ml,搖勻,作為分離度測試溶液②。分別精密量取分離度測試溶液①和②各20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖。西索米星峰與慶大霉素C1a峰的分離度為1.2;在相對保留時間0.80~0.95處應(yīng)能檢測出三個氧化降解物。見圖1。
2.2溶液制備
2.2.1供試品溶液 取本品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含西索米星3 mg的溶液,作為供試品溶液。
2.2.2自身對照溶液 精密量取供試品溶液適量,加水稀釋制成每1 ml中約含西索米星15、30和120 μg的溶液,作為自身對照溶液①、②和③。
2.3破壞試驗 取硫酸西索米星適量,進(jìn)行①酸(50%三氟乙酸溶液1 ml,水浴5 min)、②堿(濃氨溶液0.5 ml,水浴1 h)、③氧化(10%過氧化氫溶液0.5 ml,水浴45 min),分別用水稀釋制成每1 ml中含3 mg的溶液,④熱(水溶液,水浴1 h)和⑤紫外光(254 nm)(水溶液,照射24 h)破壞,進(jìn)樣測定,色譜圖見圖2。各破壞條件下,降解產(chǎn)物峰均能與西索米星峰良好分離。破壞試驗表明,本法可有效檢出分解產(chǎn)物。
1.西索米星 2.慶大霉素C1a 3.三個氧化降解物
2.4穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液室溫分別放置0、4和8 h時測定有關(guān)物質(zhì),結(jié)果表明硫酸西索米星供試品溶液室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定,總雜質(zhì)分別為3.32%、3.30%和3.28%,最大單一雜質(zhì)分別為2.01%、2.02%和2.01%。
2.5線性試驗和最低檢出量 取西索米星對照品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含西索米星1 mg的溶液,精密量取此溶液0.75、1.5、3.0、6.0和12.0 ml,分別置5個100 ml量瓶中,均加水稀釋至刻度,搖勻。分別精密量取各溶液20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖。硫酸西索米星進(jìn)樣量(以西索米星計算)在0.15~2.38 μg范圍內(nèi),峰面積對數(shù)(Y)與進(jìn)樣量對數(shù)(X)線性相關(guān):Y=1.725 0X+5.954 2(r=0.999 8)。以信噪比3為限,在此色譜條件下,西索米星有關(guān)物質(zhì)檢查最低檢出量為57 ng。
1.西索米星
2.6有關(guān)物質(zhì)的測定 按照“2.2”項下的方法制備供試品及自身對照溶液,在“2.1”項下色譜條件下,精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。以自身對照溶液濃度的對數(shù)值與相應(yīng)峰面積的對數(shù)值計算回歸方程,用回歸方程計算單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)的含量。結(jié)果見表1。
表1 樣品測定結(jié)果
3.1流動相的選擇 氨基糖苷類抗生素極性較大,在ODS柱上不保留,可通過與揮發(fā)性酸形成離子對或采用堿性流動相使氨基糖苷類抗生素游離成堿,降低極性以增加在色譜柱上的保留[3]。
采用堿性條件[4],試驗了乙酸胺系統(tǒng),試驗結(jié)果表明,流動相為堿性時,雜質(zhì)峰分離度不好,西索米星色譜峰峰形不對稱。
采用酸性條件,試驗了五氟丙酸系統(tǒng)[5],試驗結(jié)果表明,隨著五氟丙酸濃度的增大,主峰前的雜質(zhì)峰與主峰的分離度變大,但出峰時間較晚,主峰峰形不對稱。試驗了三氟乙酸流動相系統(tǒng)[3],隨著流動相中三氟乙酸濃度的增加,西索米星色譜峰的保留時間減少,峰形改善,檢出雜質(zhì)也相應(yīng)的增加。在流動相中添加丙酮和四氫呋喃,雜質(zhì)峰均未分離;添加乙腈和甲醇,各雜質(zhì)峰的分離較好。將流動相中的有機(jī)相改為甲醇和乙腈的混合溶液,保證了色譜峰的峰形和分離度,增加了流動相中有機(jī)相的比例,結(jié)果較為滿意。因此選擇三氟乙酸作為流動相的離子對試劑對西索米星進(jìn)行分析。
3.2蒸發(fā)光散射檢測器條件的選擇 考察漂移管溫度分別為80、100、105、110和115 ℃時的分析情況,試驗結(jié)果表明,漂移管的溫度對檢測結(jié)果影響不顯著。分別考察載氣流速為2.0、2.5 、3.0 和3.5 L/min 時的分析情況,試驗結(jié)果表明隨著載氣流速的減小,峰面積增大,基線則越不穩(wěn)定。綜合試驗結(jié)果,確定漂移管溫度為110 ℃,載氣流速為3.0 L/min。
3.3本試驗中根據(jù)保留時間一致,暫稱西索米星主峰后緊鄰的雜質(zhì)為慶大霉素C1a,并未進(jìn)行其他確證試驗。
3.4色譜柱的粗放度 采用Diamonsil C18100 A(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和CAPCELL PAK TYPE:ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱不同時間測定20070503批樣品,結(jié)果見表2。結(jié)果表明,檢測結(jié)果基本一致。
表2 采用不同色譜柱測定結(jié)果的比較
本方法采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器檢測,樣品不需要衍生化,可避免測定過程引入新的雜質(zhì),提高了分析精度,相較于傳統(tǒng)薄層色譜法有更高的靈敏度及準(zhǔn)確性,可以提高產(chǎn)品的質(zhì)控水平,增加藥品使用安全性。
1 陳冠華,潘淑萍,胡江寧.硫酸阿米卡星含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC-ELSD測定.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2005,36(3):171
2 吳燕,張勝強(qiáng),郭成明,等.HPLC-ELSD法分析硫酸奈替米星與硫酸西索米星的含量和有關(guān)物質(zhì).中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2004,5(4):35
3 王建, 王知堅, 陳貴斌, 等.HPLC-ELSD和HPLC-MSn分析硫酸西索米星及其注射液.中國藥學(xué)雜志,2007,42(1): 62
4 Wang Mingjuan, Hu Changqin.Analysis of spectinomycin by HPLC with evaporative light-scattering detection.Chromatographia,2006,63(5/6):255
5 Megoulas N C,Koupparis M A.Development and validation of novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals,plasma,and urine.Anal Bioanal Chem,2005,382(2):290
6 劉海玲,曹曉云. HPLC-ELSD法測定硫酸西索米星的含量.天津藥學(xué),2011,23(4):3