臍血漿在CIK細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

席作明，趙 青，周長(zhǎng)輝，陳雙峰*

(1聊城市東昌府區(qū)婦幼保健院，山東聊城252000;2聊城市人民醫(yī)院)

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)是一類非MHC限制性的免疫活性細(xì)胞，具有擴(kuò)增能力強(qiáng)、殺瘤活性高和抗瘤譜廣的特點(diǎn)［1］，是目前腫瘤過(guò)繼性免疫治療的主要細(xì)胞［2］。以往CIK細(xì)胞主要由患者外周血的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)而成，因受治療周期及患者身體素質(zhì)的影響，其應(yīng)用受到一定限制。研究發(fā)現(xiàn)，臍血來(lái)源的CIK細(xì)胞初始提取效率高，擴(kuò)增速度快，殺傷活性及主要效應(yīng)細(xì)胞陽(yáng)性比例高［3，4］，為 CIK 細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了更為廣泛的細(xì)胞來(lái)源。但CIK細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要大量的人AB血漿，給臨床應(yīng)用帶來(lái)了一定的困難。2009～2010年，我們應(yīng)用臍血漿進(jìn)行臍血CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，并與人AB血漿培養(yǎng)的臍血CIK細(xì)胞進(jìn)行了比較，探討其替代人AB血漿的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 白血病K562細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室凍存;無(wú)菌采集的臍帶血100 ml為我院婦產(chǎn)科提供，來(lái)自健康正常分娩產(chǎn)婦。主要試劑及儀器:重組人IFN-γ，重組人IL-2、抗CD3單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Pepro-Tech公司;Ficoll Paque PREMIUM 1.077 、磷酸緩沖液PBS購(gòu)自美國(guó)GE公司;CD3-FITC/CD56-PE、同亞型對(duì)照抗體兔抗鼠IgG、BDFACS Aria流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;AB血清購(gòu)自杭州四季青公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;IL-2、IL-12、GM-CSF ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臍血漿細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)正常人外周血漿及臍血漿中IL-2、IL-12、粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的含量，具體步驟按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 臍血漿及臍血單個(gè)核細(xì)胞制備 將臍帶血置于50 ml無(wú)菌離心管中，2 000 r/min離心10min，取上層血漿，56℃，滅活30min，分裝后置于－80℃凍存?zhèn)溆?。用等體積PBS稀釋沉淀，輕輕混勻，按1∶1(體積比)比例緩慢疊加于含有Ficoll分離液的50 ml離心管中，1 800 r/min離心30min。吸取中間層單個(gè)核細(xì)胞層并用適量PBS懸浮細(xì)胞，2 000 rpm水平離心5min，PBS洗滌細(xì)胞2次。

1.2.3 CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 臍血單個(gè)核細(xì)胞于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，棄去貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml。分為兩組，AB血漿組加入含10%AB血漿的RPMI1640培養(yǎng)基;臍血漿組加入含10%臍血漿的RPMI1640培養(yǎng)基。兩組均加入IFN-γ 1 000 U/ml(第0天)，24 h后，加人CD3單克隆抗體 50 ng/ml、IL-2 500 U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每 3 d全量換液1次，并補(bǔ)充IL-2 500 U/ml。培養(yǎng)21 d后收獲細(xì)胞。

1.2.4 CIK細(xì)胞計(jì)數(shù)及免疫表型測(cè)定 取部分細(xì)胞置EP管內(nèi)經(jīng)PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，分別加入 6 μl抗人 CD3-FITC，CD56-PE，對(duì)照管分別加入同量的抗人IgG1-FITC，IgG1-PE單克隆抗體，混勻后室溫下避光孵育20min，采用流式細(xì)胞儀分別于第0、5、7、14、21 天計(jì)數(shù) CIK 細(xì)胞，比較其擴(kuò)增情況。于第0、21天測(cè)定CIK細(xì)胞表面抗原及

1.2.5 CIK細(xì)胞毒性檢測(cè) 將培養(yǎng)21 d的CIK濃度調(diào)整為2×106/ml，K562細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml，按效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞 =1∶1，10∶1，20∶1 的比例放入96孔板，另設(shè)單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞和單獨(dú)靶細(xì)胞孔，每組設(shè)5個(gè)平行孔，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，然后每孔中加入10 μl CCK-8溶液并放置培養(yǎng)箱中孵育2 h，450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞殺傷活性。細(xì)胞毒活性計(jì)算公式:殺傷活性(%)=［靶細(xì)胞 A值 －(效應(yīng)細(xì)胞 A值 －實(shí)驗(yàn)組 A值)］/靶細(xì)胞A值×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞的擴(kuò)增情況 兩組CIK細(xì)胞均可大量增殖，前5 d增殖較為緩慢。在第7天細(xì)胞開始快速增殖，培養(yǎng)21 d后臍血漿組及AB血漿組CIK細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異;CIK細(xì)胞增殖倍數(shù)分別為(81.3 ±9)、(75.7 ±8)倍，P ＞0.05。免疫表型檢測(cè)結(jié)果見表1，兩組細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

表1 兩組單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)前后表面抗原變化(n=5，%，±s)

表1 兩組單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)前后表面抗原變化(n=5，%，±s)

細(xì)胞0天 第21天CD+3CD+56 7 ±0.60 29.3 ±2.6 AB血漿組55.7 ±9 96.4 ±5 1.57 ±0.60 28.7 ±3.1

2.2 CIK細(xì)胞殺傷活性 見表2。

表2 不同效靶比臍血CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用(n=5，%，±s)

表2 不同效靶比臍血CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用(n=5，%，±s)

注:與同組10∶1比較，*P ＜0.01;與同組20∶1 比較，△P＜0.01

1∶1 10∶1 20∶1臍血漿組 14.1 ±4.2 42.8 ±9.1* 56.7 ±12.5組別 效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＊△AB 血漿組 13.6 ±4.0 43.7 ±9.8* 55.8 ±12.0＊△

2.3 臍血漿IL-2、IL-12、GM-CSF含量 見表3。

表3 臍血漿及人正常外周血漿中IL-2、IL-12、GM-CSF 含量(n=5，±s)

表3 臍血漿及人正常外周血漿中IL-2、IL-12、GM-CSF 含量(n=5，±s)

注:與 AB 血漿組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

IL-2 IL-12 GM-CSF臍血漿組 389.6 ±45.7* 1 172.1 ±229.5△ 121.3 ±23.5組別△AB血漿組311.6 ±46.5 332.5 ± 78.9 13.6 ± 3.2

3 討論

血漿是CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中的重要添加成分，可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)因子。應(yīng)用人AB血漿培養(yǎng)CIK細(xì)胞可能占用臨床血漿治療資源，同時(shí)，同種異體血漿中抗體的異質(zhì)性可能會(huì)影響到CIK細(xì)胞的表型變化，給臨床應(yīng)用帶來(lái)了一定困難。臍血來(lái)源廣泛，采集方便，免疫原性低，不會(huì)給捐獻(xiàn)者帶來(lái)痛苦和感染，如能替代AB血漿進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)，不僅節(jié)省資源，還可望能提高CIK細(xì)胞增殖能力和殺傷活性，增強(qiáng)過(guò)繼免疫治療效果。細(xì)胞因子是影響CIK細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)鍵因素，各種來(lái)源CIK細(xì)胞在其培養(yǎng)過(guò)程中均需添加多種細(xì)胞因子，如 IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-12、GM-CSF 等［5～8］。IL-2可提高抗腫瘤活性、促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖分化，還能與CD3mAb、IFN-γ產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖，提高CIK細(xì)胞增殖率。IL-12是免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，可刺激多種免疫細(xì)胞的增殖和殺傷作用，對(duì)CIK細(xì)胞的增殖同樣具有促進(jìn)作用，可以和IL-2協(xié)同促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖，提高CIK細(xì)胞數(shù)量。IL-12具有多重抗腫瘤生物活性，不僅對(duì)腫瘤有直接的抑制作用，而且可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，使其處于有效發(fā)揮抗腫瘤作用的細(xì)胞免疫應(yīng)答狀態(tài)，在CIK細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加適量IL-12可以顯著增強(qiáng)其殺傷活性［7，8］。GM-CSF主要由活化的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)殺菌及抗腫瘤作用［9］，添加GM-CSF可使CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)進(jìn)一步提高。本研究發(fā)現(xiàn)，臍血漿中IL-2、IL-12、GM-CSF的含量均高于正常人外周血漿，可有效增強(qiáng)臍血CIK細(xì)胞的增殖能力及殺傷活性。本研究顯示臍血漿誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞無(wú)論是增殖能力，CD+3CD+56效應(yīng)細(xì)胞陽(yáng)性率還是對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活力與人AB血漿相比均無(wú)顯著性差異，證明臍血漿可代替AB血漿進(jìn)行臍血CIK細(xì)胞的培養(yǎng)。

總之，臍血漿可代替人AB血漿培養(yǎng)出具有高效增殖能力及高殺傷活性的臍血CIK細(xì)胞，臍血漿的應(yīng)用可為CIK細(xì)胞的培養(yǎng)提供新的、高效的血漿來(lái)源，為推廣CIK細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供保證。

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