UPS抑制劑對(duì)成年大鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)新生的影響

高 林 田元元 薛 春 商超蔚 李林英 王慧宇 苗云飛 亢園園 賀維亞

河南大學(xué)臨床學(xué)院 開封 475000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease，AD）的病理改變以腦組織內(nèi)出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失為特征。而Aβ的沉積是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［1］。另外，Dickson等人報(bào)道［2］，正常老年人尸檢也能見到老年斑，但卻未發(fā)病，看來AD和正常老年人之間并無質(zhì)的區(qū)別。為此，我們認(rèn)為這可能與腦內(nèi)異常蛋白的處理、降解β淀粉樣蛋白的處理能力（也即泛素－蛋白酶體系統(tǒng)）不同有關(guān)。筆者采用腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑，建立腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積大鼠模型，以觀察大鼠行為學(xué)、腦內(nèi)淀粉樣蛋白和神經(jīng)新生的影響，探討阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制和制定治療策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品：①試劑：尿嘧啶脫氧核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）購于美國Sigma公司。BrdU抗體、鏈霉卵白素（SP）染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購自北京中山試劑公司。②水迷宮（張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠），江灣Ⅰ型C立體定向儀（第二軍醫(yī)大學(xué)），微量注射器（上海華亭精密儀器廠）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性SD大鼠57只，鼠齡2個(gè)月。體質(zhì)量200～300g，平均260g左右，均由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 學(xué)習(xí)記憶測(cè)試方法：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行水迷宮測(cè)試。5次／d，2min／次，共5d。第3d開始記錄逃避潛伏期（大鼠從入水至找到并爬上平臺(tái)所需時(shí)間），一般在第3d動(dòng)物逃避潛伏期均在20s內(nèi)。如在第5天，動(dòng)物逃避潛伏期仍大于20s即作為淘汰指標(biāo)。共淘汰12只動(dòng)物，其中死亡6只，1只視力障礙。造模2個(gè)月后，再次行水迷宮測(cè)試，5次／d，2min／次，共5d，第3天開始記錄逃避潛伏期。

1.2.2 分組與動(dòng)物模型制備：57只大鼠分別分為實(shí)驗(yàn)組（腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑）、對(duì)照組和正?？瞻捉M等3組，實(shí)驗(yàn)組15只，對(duì)照組15只，空白組15只動(dòng)物。參照Ni等［1］的方法制備大鼠模型（腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑0.03mg／kg），對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。所有大鼠手術(shù)后均置于通風(fēng)的動(dòng)物房飼養(yǎng)60d后，各組進(jìn)行行為學(xué)習(xí)記憶測(cè)試。飼養(yǎng)和造摸期間共淘汰9只（實(shí)驗(yàn)組3只，對(duì)照組4只，空白組2只）。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)：①BrdU染色法［3］：腹腔注射Brdu（50 mg／kg），1次／8h，3次／d，連續(xù)注射5d。末次注射24h后經(jīng)左心室常規(guī)灌注多聚甲醛沖洗，常規(guī)固定、脫水、浸蠟、包埋，石蠟切片，層厚約為5μm，免疫染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，腦組織切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，2min／次。DNA變性處理：50%formamide／2×SSC（枸櫞酸鹽水）于65℃下共反應(yīng)2h，傾去液體后以2×SSC沖洗5min；2mol／L鹽酸37℃處理30min；以pH 值為8.5的硼酸緩沖液沖洗后室溫下反應(yīng)10～15min，而后用含10%血清、0.1%Ttiton 100的磷酸鹽緩沖液37℃封閉30min，加入鼠抗Brdu 4℃過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，10min／次；加入稀釋的生物素化兔抗小鼠二抗（1∶80），37℃反應(yīng)2h；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，5min／次；加入辣根過氧化物酶室溫下反應(yīng)1h后DAB顯色，室溫晾干，二甲苯透明后中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖情況。②改進(jìn)的甲醇剛果紅染色：行為學(xué)記憶測(cè)試結(jié)束后，斷頭取腦，用冰凍生理鹽水沖去血漬，置新配4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。取海馬腦組織塊做冠狀切片，常規(guī)脫臘至水，Harris蘇木精染色5～10min，溫水顯藍(lán)，自來水沖洗數(shù)分鐘，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，溫水顯藍(lán)，自來水沖洗數(shù)分鐘，甲醇剛果紅染色15min，自來水沖洗數(shù)分鐘，0.2%酒精分化數(shù)秒鐘，溫水顯藍(lán)，自來水沖洗數(shù)分鐘，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2.4 半定量分析：每只大鼠隨機(jī)選取6張非連續(xù)腦組織切片，于光學(xué)顯微鏡下任選5個(gè)高倍視野（×200）觀察計(jì)數(shù)雙側(cè)海馬區(qū)BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)量。采用雙盲隨機(jī)法計(jì)算視野中陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶測(cè)試 正常空白組和對(duì)照組大鼠的學(xué)習(xí)記憶測(cè)試結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于正?？瞻捉M（P＜0.05）。見表1。

2.2 免疫組化檢測(cè)

2.2.1 BrdU染色：光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，各組大鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞呈單個(gè)或兩個(gè)分布，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，主要分布于齒狀回顆粒細(xì)胞層亞顆粒增生帶中（圖1～3）。實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較 （）

表1 各組大鼠逃避潛伏期和海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較 （）

注：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，▲P＜0.05；與空白組比較，●P＜0.05；對(duì)照組與空白組相比較，△P＞0.05

2.2.2 剛果紅染色：對(duì)照組與空白組（圖4）相比，海馬區(qū)可見神經(jīng)元旁有少量的染色陽性物質(zhì)，其周圍神經(jīng)元形態(tài)基本正常，細(xì)胞排列層次稍有紊亂（圖5）。實(shí)驗(yàn)組與空白組相比，海馬區(qū)可見神經(jīng)元旁有大量的染色陽性物質(zhì)，其周圍神經(jīng)元皺縮，細(xì)胞排列層次明顯紊亂，可見明顯的膠質(zhì)細(xì)胞浸潤（圖6）。

3 討論

β－APP（β－amyloid precursor protein）是一種跨膜蛋白，廣泛表達(dá)在各種類型和腦各部分的神經(jīng)元，生理情況下合成后的APP僅10%成為跨膜蛋白，大部分在胞內(nèi)被α－分泌酶水解生成具有明顯神經(jīng)營養(yǎng)作用的可溶性 Appα［4-5］。同時(shí)β－APP也是一種應(yīng)激蛋白，在有害刺激作用下，β－APP表達(dá)上調(diào)，Aβ生成增加而可溶性Appα減少。但正常情況下機(jī)體修復(fù)機(jī)制可以及時(shí)降解應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的Aβ而避免其累積［6-7］。

泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin－proteasome sytem，UPS）是真核細(xì)胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解通路。UPS能夠利用其末端76位的甘氨酸與目的靶蛋白的α或ε－氨基共價(jià)結(jié)合，使目的蛋白能夠帶上泛素化標(biāo)記，以便進(jìn)一步降解。細(xì)胞內(nèi)蛋白的泛素化作用參與了多種細(xì)胞生物學(xué)功能，例如細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增生與分化、細(xì)胞凋亡等［8］。在UPP中E3連接酶是其選擇性降解機(jī)制的關(guān)鍵因素，能夠?qū)b、底物蛋白還有26S蛋白酶體連接起來，起到了橋梁的作用。UPP中E3連接酶的數(shù)量眾多，有研究表明，其中多種E3連接酶如parkin、HRD1、CHIP等都能夠參與調(diào)控AD中兩個(gè)重要效應(yīng)分子tau蛋白和Aβ的降解［9-10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑2個(gè)月后，空白組未發(fā)病，說明空白組修復(fù)機(jī)制是正常的，可以降解或吞噬大量的Aβ而避免其沉積發(fā)揮神經(jīng)毒性，保護(hù)了周邊的神經(jīng)元。而實(shí)驗(yàn)組結(jié)果說明機(jī)體的修復(fù)機(jī)制存在障礙，沉積的淀粉樣蛋白使得其周邊的神經(jīng)元皺縮或丟失，從而表現(xiàn)出行為學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)提示我們：泛素蛋白酶體系統(tǒng)衰退，促使了淀粉樣的沉積。

在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)尿嘧啶脫氧核苷標(biāo)記染色后顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖能力明顯下降，分析原因可能與淀粉樣蛋白沉積對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖有抑制作用，這與體內(nèi)［8］和體外［11-12］實(shí)驗(yàn)研究淀粉樣蛋白對(duì)PC12細(xì)胞的增殖有抑制作用相一致。至于淀粉樣蛋白對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的抑制作用是通過什么信號(hào)傳導(dǎo)途徑需進(jìn)一步研究和探討。

圖1 空白組海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)（×200）

圖2 對(duì)照組海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)（×200）

圖3 實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)（×200）

圖4 空白組海馬區(qū)淀粉樣蛋白沉積的變化（×200）

圖5 對(duì)照組海馬區(qū)淀粉樣蛋白沉積的變化（×200）

圖6 實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)淀粉樣蛋白沉積的變化（×200）

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