犢牛腦炎病原菌的分離鑒定及病理組織學觀察

羅繼分，王靜梅，剡根強

（石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003）

2009年初冬至2011年初春季節(jié)，新疆石河子某規(guī)?；膛龅牟糠殖跎鸂倥ｊ懤m(xù)發(fā)生了以腦炎為主的病例。發(fā)病犢牛表現(xiàn)體溫升高，咳嗽，共濟失調(diào)，頭低耳耷，拱背，精神沉郁，消瘦，抗生素治療效果不佳，先后死亡9頭。剖檢瀕死期犢牛發(fā)現(xiàn)，肺臟出血且有肉變，腎盂出血，小腸嚴重出血，腸黏膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)腫大，腦膜廣泛的小點出血。為查明導致該病發(fā)生的主要致病菌，本研究對患腦炎的犢牛進行了病原菌的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原材料 采集新疆石河子某發(fā)病牛場的犢牛肝臟、腸淋巴結(jié)、脾臟、心血和肺臟等共24份。1.1.2 培養(yǎng)基與生化試劑 LB血培養(yǎng)基，鏈球菌選擇培養(yǎng)基，肉肝湯厭氧培養(yǎng)基，各種生化試驗用培養(yǎng)基等參照文獻［1］配制。

1.1.3 分離株16SrDNA測序 由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測定；分子生物學試劑DNA Marker DL 2 000，Taq酶（5U／μL）、dNTP（10mmol／L）均為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；根據(jù)測序結(jié)果選擇最合適的序列設計引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.4 實驗動物 健康小鼠和家兔，購自于石河子大學實驗動物中心。

1.1.5 病理切片 采集發(fā)病犢牛和人工感染死亡的小鼠的腦組織，制作石蠟切片。

1.1.6 藥敏試驗 阿奇霉素、阿莫西林、四環(huán)素、羅紅霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、萬古霉素、利福平、泰樂菌素、土霉素、青霉素、頭孢噻呋鈉、慶大霉素、恩諾沙星、卡那霉素、氟苯尼考等藥敏片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1染色鏡檢 將病料組織抹片進行瑞特染色，鏡檢觀察細菌染色特性及形態(tài)特征。

1.2.2 分離培養(yǎng) 無菌采集瀕死期及死亡的犢牛的肝臟、心血、肺臟，分別接種于LB血肉湯培養(yǎng)基和厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中增菌培養(yǎng)24h后，革蘭染色鏡檢，初步篩選出革蘭陽性球菌，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于LB鮮血平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)并染色鏡檢，挑選革蘭陽性球菌的單個菌落接于鮮血LB平板培養(yǎng)基分別置于37℃恒溫培養(yǎng)箱和體積分數(shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行分離純化。培養(yǎng)24h后，挑選單個菌落接于鮮血LB平板和鏈球菌選擇培養(yǎng)基，置體積分數(shù)為5%CO2中培養(yǎng)，觀察細菌菌落形態(tài)和溶血情況。

1.2.3生化鑒定 分離菌的生化鑒定參照文獻［2－3］的方法進行。

1.2.4 分離株16SrDNA測序 將純培養(yǎng)物送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行測定。

1.2.5 PCR鑒定

（1）引物 上游引物：GCGGTGGAGCATGTGGTT；下游引物：GTGTGACGGGCGGTGTGT。擴增產(chǎn)物片段大小為472bp。

（2）PCR模板 肉湯純培養(yǎng)物以12 000r／min離心10min，去上清，加200μL超純水混勻后100℃水浴10min，再冰浴2min，12 000r／min離心2 min，取上清至另一離心管中置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）PCR反應體系（25μL） 10×buffer 2.5 μL，2.5mmol／L dNTP 1.5μL，上、下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶（5U／μL）0.5μL，模板2.5 μL，無菌雙蒸水補至25μL。PCR反應條件95℃預變性5min；94 ℃ 1min，55.6 ℃ 30s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃結(jié)束反應。PCR結(jié)果觀察：將PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.6 動物試驗 健康小鼠20只，分為2組，10只腹腔注射分離菌肉湯培養(yǎng)物，每只小鼠注射量為9×109cfu，另10只腹腔注射無菌生理鹽水作為對照組，每日觀察小鼠發(fā)病情況。

取健康家兔6只，4只分別耳緣靜脈注射分離株肉湯培養(yǎng)物，注射量均為18×109cfu；另2只分別耳緣靜脈注射無菌生理鹽水作對照，觀察家兔發(fā)病及死亡情況。

1.2.7 病理組織學觀察 參照文獻［4－5］采集發(fā)病犢牛和死亡小鼠的腦組織制作石蠟切片，HE染色，光鏡觀察其病理變化。

1.2.8 藥敏試驗 用K－B紙片法進行藥敏試驗，參考王建永等［6］的試驗方法，依照NCCLS（美國臨床實驗室標準化委員會）標準判定試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1細菌形態(tài)觀察

病死犢牛的肺臟，肝臟和心血抹片瑞氏染色鏡檢，可見長鏈，短鏈和成對排列的球菌。病死犢牛和小鼠分離培養(yǎng)物革蘭染色呈鏈狀排列的陽性球菌，有莢膜。

2.2 病原菌分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性

病料接入肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，溶液變渾濁，肉肝湯培養(yǎng)基有氣體產(chǎn)生。分離菌在普通瓊脂上生長貧瘠且緩慢，在鮮血LB平板上培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)圓形白色隆起，微溶血現(xiàn)象。在鏈球菌選擇培養(yǎng)基上為白色隆起，邊緣整齊的針尖大小菌落，在體積分數(shù)為5%CO2中生長良好。

2.3 生化鑒定結(jié)果

分離菌在400mL／L膽汁、甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七葉苷、精氨酸中生長；在溫度為10℃和45℃時不生長，在pH 9.6、650g／L NaCl中不生長；不能利用阿拉伯糖、菊糖、棉子糖和鼠李糖。結(jié)果表明，分離株符合乳房鏈球菌的生化特性。

2.4 16SrDNA測序結(jié)果

將測序所得基因序列與GenBank上發(fā)表的序列進行比對，同源性為98.7%。

2.5 PCR鑒定

提取分離菌的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增出472bp的特異性條帶見圖1。

圖1 乳房鏈球菌特異性基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of specific gene in Streptococcus uberis

2.6 動物試驗結(jié)果

注射分離菌后，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁，消瘦，呼吸急促，靜臥不動等癥狀。小鼠在1周內(nèi)死亡5只，死亡率為50%（5／10），對照組正常，剖解死亡小鼠，腹腔有化膿性積液，積液瑞氏染色鏡檢可見大量鏈狀球菌，有莢膜。感染家兔未見死亡，但明顯消瘦。

2.7 病理組織學觀察結(jié)果

病理組織學觀察結(jié)果見圖2。從圖2箭頭所指處可以看到腦組織血管擴張充血，血管和神經(jīng)細胞外圍有較大的空隙。

圖2 犢牛腦組織石蠟切片F(xiàn)ig.2 Paraffin sections of calf brain tissue

2.8 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果見表1。

表1 分離株的藥敏試驗結(jié)果Table 1 The results of drug sensitivity test of isolate

3 討論

目前能夠引起動物腦炎的病原有細菌、病毒、真菌、立克次體、原蟲等。細菌主要有肺炎鏈球菌、腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、B族鏈球菌和奈瑟球菌等［3－4］。病毒主要有單純皰疹病毒、日本腦炎病毒、西尼羅腦炎病毒等約有一百多種病毒可致人和動物腦炎［5］。

乳房鏈球菌是導致規(guī)?；膛鋈榉垦椎囊粋€重要原因，使泌乳期和非泌乳期奶牛感染臨床和亞臨床的比例增高。乳房鏈球菌被視為環(huán)境乳腺炎病原體，它已在牛場環(huán)境中無處不在，并廣泛分布，可以從墊層，草料和乳房內(nèi)及奶牛乳房外的其他部位分離到乳房鏈球菌，且其檢出率還很高［6］，說明乳房炎主要是由于環(huán)境中的乳房鏈球菌感染［7］。那么導致犢牛感染的乳房鏈球菌也很有可能來源于環(huán)境，或感染乳房鏈球菌的亞臨床型乳房炎奶牛的乳汁，犢牛也可能由于食用了攜帶病原體的初乳和未經(jīng)加熱處理的混合常乳而感染，有關(guān)引起犢牛感染的報道甚少。

犢牛發(fā)病主要在初冬至初春季節(jié)，據(jù)報道［8］，乳房鏈球菌能在低溫環(huán)境中存活。尤其是在寒冷季節(jié)，由于管理不當便會促使乳房鏈球菌大量繁殖。環(huán)境中的乳房鏈球菌增加，使得犢牛感染乳房鏈球菌的機率增加。目前在全世界范圍內(nèi)，環(huán)境中的乳房鏈球菌已被報道是導致臨床和亞臨床乳房炎的一個主要因素［9－10］。

本試驗中從病死犢牛的樣品的分離培養(yǎng)物和小鼠的腹腔液抹片中都可見分離株有莢膜，但分離株培養(yǎng)傳代幾代后莢膜消失。是否與分離株乳房鏈球菌發(fā)生了變異有關(guān)還需要進一步研究。在血平板培養(yǎng)基上有微溶血，這符合乳房鏈球菌的生長特性。動物接種后小鼠死亡，說明分離株有致病性。乳房鏈球菌的毒力基因主要有hasA，hasB，hasC，oppE，pauA，pauB和skc等，這些基因都與乳房炎的發(fā)生有關(guān)［11］。其中pauA基因在乳房炎病原體的致病性方面伴有相當重要的角色［12］。上述毒力基因是否都能引起腦炎發(fā)生，或者只是其中一種基因，還需要進一步探索研究。這將是以后深入研究乳房鏈球菌致病性的一個重要方向。

從病理組織切片中可以觀察到腦組織血管擴張充血，血管和神經(jīng)細胞外圍有較大的空隙。這些病理性變化表明犢牛的腦組織受損，從而表現(xiàn)出腦炎癥狀。雖然乳房鏈球菌能夠到達人的眼球使人發(fā)生眼疾［13］，但是目前還沒有見到關(guān)于乳房鏈球菌具有致腦炎的特性的報道，而且它是如何通過血腦屏障的，其機理尚不清楚。

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