一株鴨源大腸埃希菌強(qiáng)毒株的分離鑒定

張文波，冷 闖，鄧舜洲＊，蔣新華，余根蓮

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2.南昌金牧動(dòng)物保健服務(wù)有限公司，江西南昌 330013）

2010年9月初，江西某規(guī)?；唸?chǎng)的雛鴨突然發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)100%，病死率40%左右。主要臨床癥狀為嗜睡，共濟(jì)失調(diào)，食欲減退或廢絕，排黃綠色或惡臭稀糞，有的鴨迅速死亡。用磺胺和喹喏酮類藥物效果不明顯。剖檢主要病理變化有肝周炎、纖維素性心包炎、脾臟呈紫黑色斑紋狀、肺有淤血或水腫，腹水為淡黃色、腸道黏膜呈卡他性或壞死性炎癥。實(shí)驗(yàn)室診斷為大腸埃希菌病，并分離到一株強(qiáng)毒力大腸埃希菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 江西某養(yǎng)鴨場(chǎng)的病死鴨。

1.1.2 藥敏紙片 （批號(hào)：20101006）和微量生化鑒定管（批號(hào)：20101102）均為杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 20日齡非免疫櫻桃谷鴨購自南昌市某種鴨場(chǎng)；昆明系小鼠，體重15g左右，購自于南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 在無菌條件下取送檢病死鴨的肝臟、心臟，劃線接種于兔血瓊脂平板、普通瓊脂平板和麥康凱平板，37℃培養(yǎng)12h，觀察菌落形態(tài)、大小和顏色等，挑單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)特征。挑單個(gè)菌落分別接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板和SS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h，觀察細(xì)菌的培養(yǎng)特性。

1.2.2 生化試驗(yàn) 挑取分離菌純培養(yǎng)物接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200r／min，振蕩培養(yǎng)10h～12h。然后將培養(yǎng)的菌液接種于微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn) 取培養(yǎng)的菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，并稀釋到濃度為105cfu／mL，取0.2mL通過腹腔注射小鼠，同時(shí)用普通肉湯進(jìn)行腹腔注射小鼠作正常對(duì)照；取分離菌培養(yǎng)液0.2mL皮下接種雛鴨，同時(shí)用普通肉湯皮下接種雛鴨作正常對(duì)照，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)病及死亡情況，并從死亡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝臟和心臟中分離細(xì)菌。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 用無菌棉簽將培養(yǎng)的菌液均勻涂布于普通瓊脂平板上，貼藥敏紙片，37℃，培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

1.2.5 臨床治療 使用藥敏試驗(yàn)篩選的高度敏感藥物進(jìn)行治療，并采取消毒等綜合防控措施，觀察治療效果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離純化

劃線接種的平板，37℃培養(yǎng)12h。在血平板上形成圓形、稍凸、邊緣整齊、灰白色、不透明的菌落，有明顯的β溶血環(huán)；普通培養(yǎng)基上形成均一的菌落，呈中等大小、圓形、凸起、濕潤、灰白色半透明、邊緣整齊。革蘭染色為陰性，散在或成對(duì)排列、兩端鈍圓的短桿菌。麥康凱培養(yǎng)基上形成紅色、圓形隆起、濕潤和邊緣整齊的中等大小菌落。從麥康凱培養(yǎng)基上挑單個(gè)菌落接種于伊紅美藍(lán)平板上，可形成紫黑色帶金屬光澤的菌落。SS瓊脂平板上形成紅色的菌落。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

該分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、木糖、乳糖、棉子糖和山梨醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；鼠李糖、觸酶和甲基紅陽性；吲哚、H2S、枸櫞酸鹽、VP和尿素為陰性。符合大腸埃希菌的生化特征。結(jié)合分離菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性及部分生物學(xué)性狀，鑒定為大腸埃希菌。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

腹腔注射分離菌培養(yǎng)液的5只小鼠在12h內(nèi)全部死亡；皮下注射分離菌培養(yǎng)液的5只雛鴨在16 h內(nèi)全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠的心臟和腸道出血、肝上有針尖大小出血點(diǎn)、脾臟呈深黑色；雛鴨有肝周炎、心包積液、纖維素性滲出、腸道出血嚴(yán)重等病變。從死亡小鼠和雛鴨的心臟、肝臟以及腹水中分離細(xì)菌，細(xì)菌的形態(tài)等生物學(xué)特性，與從病死鴨肝臟和心臟中分離的細(xì)菌一致。普通肉湯對(duì)照組全部存活。

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株對(duì)阿莫西林棒酸、頭孢克洛、奈替米星和紅霉素高度敏感，對(duì)呋喃唑酮、大觀霉素、頭孢噻吩、慶大霉素、氧氟沙星和氨芐西林中度敏感，對(duì)其他藥物為低敏或耐藥（表1）。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of drug sensitive test of isolate strains

3 討論

根據(jù)分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化試驗(yàn)結(jié)果，確定該分離菌為大腸埃希菌。分離的大腸埃希菌分別在12h致死小鼠和16h內(nèi)致死雛鴨，死亡雛鴨的病理變化與自然感染死亡鴨的病理變化完全一致［2－3］，且鴨場(chǎng)的發(fā)病率和死亡率均較高，表明本次分離菌是強(qiáng)致病性的大腸埃希菌。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對(duì)頭孢噻呋鈉、阿莫西林／棒酸、紅霉素和奈替米星高度敏感，對(duì)大觀霉素、慶大霉素、頭孢噻吩、克林霉素和左氧氟沙星中度敏感，對(duì)其它藥物均低敏或耐藥。原因可能與這類藥物在臨床上應(yīng)用不廣泛、聯(lián)合用藥效果要優(yōu)于單藥等有關(guān)，與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似［4－6］。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，在發(fā)病鴨場(chǎng)使用頭孢噻呋鈉進(jìn)行治療，連用3d，效果不明顯。換用阿莫西林／棒酸配合大觀霉素注射治療，同時(shí)采取消毒、加強(qiáng)管理等綜合防治措施，很快控制了疫情。

隨著養(yǎng)鴨場(chǎng)抗生素使用的常態(tài)化，大腸埃希菌的耐藥性也隨之不斷增強(qiáng)、變化；而且大腸埃希菌的血清型眾多，交叉保護(hù)性差，疫苗免疫效果不佳，因此通過藥敏試驗(yàn)篩選高敏藥物是治療和控制鴨大腸埃希菌病的有效途徑之一［7］。但在臨床上經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)臨床治療和藥敏試驗(yàn)結(jié)果不相符的情況，其原因主要有：①體外和體內(nèi)環(huán)境不同［8］，體內(nèi)某些細(xì)菌可以合成降解抗生素的酶，使抗生素失效，就會(huì)出現(xiàn)體外敏感而體內(nèi)耐藥的情況；②某些致病菌在體外培養(yǎng)時(shí)，因條件與體內(nèi)不同，可能發(fā)生變異而產(chǎn)生耐藥性或失去耐藥性；③致病菌判斷不正確，或者未分離到［9］。④藥敏試驗(yàn)方法選擇錯(cuò)誤導(dǎo)致藥敏試驗(yàn)結(jié)果不正確。例如根據(jù)CLSI藥敏試驗(yàn)規(guī)范，非腸桿菌科革蘭陰性桿菌除銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌可用K－B法外，假單胞菌屬其他細(xì)菌、嗜麥芽窄食單胞菌和其他不發(fā)酵葡萄糖的革蘭陰性桿菌的藥敏試驗(yàn)均需用稀釋法；⑤藥敏紙片失效，造成假耐藥情況。如放置時(shí)間過長、未按要求放置等；⑥臨床用藥劑量與藥敏試驗(yàn)的實(shí)際劑量有較大差異［10］；⑦臨床上部分細(xì)菌是條件性病原菌，要有誘因才有可能致病，若單純用藥而未清除誘因，用藥也可能無效。本研究在治療過程中出現(xiàn)高敏藥物頭孢噻呋鈉治療無效，其原因有待于進(jìn)一步研究。大腸埃希菌是一種條件性致病菌，只有當(dāng)動(dòng)物在飼養(yǎng)管理不當(dāng)、應(yīng)激、機(jī)體抵抗力降低時(shí)，才會(huì)引起較嚴(yán)重的病癥，因此在養(yǎng)鴨場(chǎng)應(yīng)在加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，降低鴨群密度，及時(shí)消毒，做好生物安全措施、減少應(yīng)激、及時(shí)隔離和淘汰病雞等方面的工作，才能有效減少該病造成的經(jīng)濟(jì)損失。

［1］Clinical and laboratory standards institute（CLSI）.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing Twentieth；informational Supplement［S］.Document M100－S20.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2010：59－123.

［2］李文楊，黃 瑜，施少華，等.我國部分地區(qū)致病性鴨大腸桿菌的分離及血清型鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45（12）：43－44.

［3］羅玲，艾地云，楊 峻，等.湖北省部分地區(qū)鴨致病性大腸桿菌的分離與血清型鑒定［J］.中國家禽，2009，31（8）：44－45.

［4］艾地云，鄧均華，羅 玲，等.武漢地區(qū)鴨源致病性大腸桿菌體外耐藥性測(cè)定［J］.中國家禽，2008，30（20）：47－49

［5］陳文靜，韓先干，何 亮，等.鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析［J］.中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，18（2）：34－40.

［6］于學(xué)輝，黃 蘭，楊曉農(nóng)，等.98株鴨源致病性大腸桿菌氨基糖苷類耐藥基因型與耐藥表型的比較［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（12）：1568－1575.

［7］李必富，王遠(yuǎn)微，于學(xué)輝，等.鴨源大腸桿菌O46血清型分離株的主要生物學(xué)特性研究［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，37（2）：238－241.

［8］劉 靜，賀生中，陳 祥，等.依賴藥敏試驗(yàn)治療雞大腸桿菌病的誤區(qū)［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，14：98.

［9］德育慧，樊明春，王 楓.復(fù)方恩諾沙星可溶性粉對(duì)畜禽主要致病菌的體外抑菌效果［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（7）：46－49.

［10］王 穎，趙秀華，李長華.細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的臨床價(jià)值及局限性［J］.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2008，19（4）：86－87.