山羊痘和綿羊痘研究進展＊

吳海燕，孫秀峰

（1.青島市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東青島 266071；2.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島 266100）

山羊痘（Goat pox，GP）和綿羊痘（Sheep pox，SP）俗稱“羊天花”，統(tǒng)稱羊痘（Capripox），是分別由山羊痘病毒（Goat pox virus，GPV）和綿羊痘病毒（Sheep pox virus，SPV）感染引起的山羊與綿羊的病毒性傳染病，皆為世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定報告的動物疫病。發(fā)病動物典型特征為體溫升高，全身性或局部呈現(xiàn)約1cm丘疹或水皰，持續(xù)3周～4周后留下永久性凹陷狀疤痕，病死率較高，羔羊病死率接近100%［1］。羊痘呈現(xiàn)地域流行性特征，可導(dǎo)致奶羊產(chǎn)奶量下降、母羊孕期流產(chǎn)、肉羊體重減輕、綿羊羊毛質(zhì)量受損等?？諝鈧鞑ァ⑽孟x叮咬和體液接觸是該病的主要傳播途徑，無母源抗體保護的羔羊和未經(jīng)羊痘疫苗免疫的成年羊最易感染羊痘，有時呈全身性皮膚病變。

1 病原

GPV和SPV分別為GP和SP的病原體，二者同屬于痘病毒科（Poxviridae）、脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）、羊痘病毒屬（Capripoxvirus）成員，同屬另有皮膚疙瘩病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）［2－3］。成熟的羊痘病毒（Capripoxvirus，CPV）顆粒呈磚形，由外膜、芯髓、側(cè)體組成，某些病毒顆粒含有囊膜。病毒大小約為300nm×270nm×200nm，表面呈現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部芯髓兩側(cè)為兩個凸透鏡狀側(cè)體。CPV在胞漿中復(fù)制，通過胞吞方式出芽，而非細胞裂解釋放病毒粒子，并可在發(fā)育的雞胚絨毛尿囊膜、羊腎和睪丸的單層細胞上良好地生長［4－5］。GPV耐干燥，對乙醚敏感，凍融對其沒有明顯滅活作用；SPV同樣可以適應(yīng)干燥環(huán)境，但對熱抵抗力較低，易被200mL／L乙醚或氯仿，或者20mL／L福爾馬林滅活［6］。CPV基因組由單分子線狀雙股DNA組成，Tulman E R等［7］比較了3個SPV野毒株和2個GPV疫苗株全基因組序列。結(jié)果表明，SPV和GPV基因組由中央編碼區(qū)和兩側(cè)相同的反向末端重復(fù)序列組成，長度約為150kb，A＋T含量約為75%；在全基因水平上，兩者具有96%同源性；在氨基酸水平上，兩者具有4%差異性；3個SPV野毒株全基因組含有147個開放閱讀框（ORF），編碼蛋白的氨基酸含量從53至2 027個不 等［7］?；?于 Tulman E R 等［7］的 研 究，Gubser C等［8］比較了這5株CPV與痘病毒科其他21株痘病毒的進化關(guān)系，結(jié)果表明，豬痘病毒（Suipoxvirus）與CPV進化關(guān)系最為密切，可能來自同一祖先。

2 羊痘流行病學(xué)

2.1 羊痘的全球性地理分布

GPV與SPV雖然具有宿主特異性，但二者可在山羊和綿羊之間傳播。某些毒株對綿羊和山羊具有相同致病性，羊痘易傳入毗鄰疫病區(qū)的國家并在其范圍內(nèi)流行［9］。GPV與SPV在全球具有不同的地理分布，疫區(qū)集中于亞洲和非洲，主要包括赤道以北非洲、北亞、中東、南亞、中亞等地區(qū)，近10年報道的疫病區(qū)主要包括越南、印度、蒙古國等，詳細信息見表1。非法動物貿(mào)易和跨國往來是羊痘傳入非疫區(qū)的主要原因，另外，氣候的改變、昆蟲的繁殖，同樣加速了病原體的跨國界傳播。

表1 2001年－2011年全球山羊痘和綿羊痘暴發(fā)情況Table 1 The global status of GP and SP outbreaks from 2001to 2011

2.2 羊痘在我國的地理分布

羊痘在我國青海、甘肅、湖南、內(nèi)蒙等地區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)羊業(yè)帶來較大經(jīng)濟損失。根據(jù)2010年《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公報》發(fā)布的疫情信息，我國14個省、自治區(qū)在該年度出現(xiàn)了羊痘疫情，其中包括：內(nèi)蒙、遼寧、吉林、江蘇、浙江、安徽、福建、湖南、貴州、云南、甘肅、青海、寧夏、新疆。筆者根據(jù)2010年《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公報》每月發(fā)布的疫情信息，總結(jié)了我國該年度羊痘的地域分布與各省、自治區(qū)發(fā)病數(shù)，詳細信息見圖1。2010年，羊痘在我國西北、華中和華南等地區(qū)廣泛流行；而華東、華北、東北地區(qū)病例較為少見。對疫區(qū)動物的隔離、健康動物的免疫和血清學(xué)監(jiān)測將是我國防控羊痘的主要措施。

圖1 2010年中國不同地區(qū)羊痘發(fā)病數(shù)Fig.1 The sick number of capripox in different regions of China

3 診斷技術(shù)

臨床利用透射電鏡檢測CPV的典型形態(tài)，結(jié)合全身性痘病毒感染史，可以對羊痘做出快速診斷。然而，此方法對儀器要求較高，所以難以廣泛應(yīng)用。利用患病動物活體淋巴結(jié)與特異性免疫血清進行瓊脂擴散試驗（AGID）可檢測其沉淀抗原，但特異性免疫血清在該方法中與副痘病毒有交叉反應(yīng)，所以限制了AGID的使用，另外，此方法的敏感性與特異性都不甚理想。病毒中和試驗（VNT）特異性較強，然而羊痘感染后主要引起細胞免疫，患病動物體內(nèi)中和抗體水平相對較低，故VNT敏感性較差［9］。ELISA和PCR檢測方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性都較為理想，且操作方便，目前被廣泛利用進行各種動物疫病的臨床診斷，較多檢測試劑盒現(xiàn)已商品化。目前，基于這兩種診斷技術(shù)已建立了多種檢測方法。

3.1 ELISA

相對于其他血清學(xué)檢測方法，ELISA的敏感性特和異性較強，Rao等通過對健康和實驗感染GPV羊的樣品進行抗原檢測，比較了抗原捕獲ELISA（IC－ELISA）和對流免疫電泳（CIE）的敏感性和特異性，結(jié)果顯示，IC－ELISA的相對特異性和敏感性分別為80%～100%和70%～86%，其敏感性優(yōu)于CIE［10］。p32蛋白是CPV的囊膜蛋白，分子質(zhì)量約為32ku，具有較強的免疫原性，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。利用p32蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法，其敏感性和特異性都較其他蛋白更為理想。Bhanot V等［11］利用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)成功地表達了GPV p32蛋白，并利用其作為包被抗原建立了間接ELISA（i－ELISA）檢測方法；結(jié)果顯示，此方法與血清中和試驗和全病毒i－ELISA相比，其相對特異性和敏感性分別為84.2%和94.2%～100%。另外，相對于原核表達系統(tǒng)，畢赤酵母真核表達系統(tǒng)所表達的p32蛋白與天然蛋白的空間構(gòu)象更為相似，將其應(yīng)用于i－ELISA將更有助于GPV血清流行病學(xué)調(diào)查。除了利用真核或原核表達系統(tǒng)表達p32結(jié)構(gòu)蛋白，也可以通過人工合成一段具有免疫原性的肽段作為包被抗原構(gòu)建i－ELISA檢測方法。Tian H等［12］利用DNA Star軟件設(shè)計并人工合成了兩段特別的多肽段，兩者分別為p32蛋白92～118和156～175殘基片段，利用其作為包被抗原建立了i－ELISA診斷方法。通過20份陽性血清和10份陰性血清的臨床檢測試驗，此方法敏感性和特異性都較為理想，且可大批量檢測臨床樣品。

3.2 PCR

PCR可用來檢測組織樣品和細胞培養(yǎng)基中的CPV。傳統(tǒng)血清學(xué)檢測方法往往伴有交叉反應(yīng)，由于PCR檢測法僅僅基于病毒核酸擴增而不涉及血清學(xué)反應(yīng)，所以相對于血清學(xué)檢測方法有一定優(yōu)勢。Markoulatos P等［13］利用3對引物建立了一步法多重PCR檢測方法，并利用其檢測了綿羊皮膚組織中的SPV。結(jié)果表明，相對于單重PCR，此多重PCR敏感性和特異性相對更高，且方便快捷，從接受樣品至報告檢測結(jié)果不超過24h。口瘡病毒（Orf virus，OV）屬副痘病毒屬成員，羊感染OV后臨床表現(xiàn)與羊痘類似，Zheng M等［14］分別設(shè)計了2對針對CPV A29L基因和OV P55基因的特異性引物，建立了區(qū)分這兩種病毒的雙重PCR檢測方法。試驗證明，此方法敏感性與特異性都較為理想，對CPV和OV的最低檢測限都為1pfu／反應(yīng)。GPV與SPV進化關(guān)系相近，所以傳統(tǒng)血清學(xué)檢測方法難以區(qū)分二者，通過分析CPV中與痘苗病毒30ku RNA聚合酶亞單位基因同源的基因發(fā)現(xiàn)，在所有CPV分離株中，唯獨SPV分離株的此同源基因缺失了21個核苷酸。基于此，Lamien C E等［15］設(shè)計了針對此同源基因的PCR檢測方法，通過每個PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶的比較可以區(qū)分GPV與SPV。

熒光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q－PCR）是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，較傳統(tǒng)PCR敏感性更高，且能夠定量檢測核酸模板。Balinsky C A等［16］建立了基于TaqMan探針的FQPCR CPV檢測方法。該方法可以檢測血沉棕黃層、口鼻拭子、瘡痂、皮膚病灶、肺部及淋巴結(jié)中的羊痘病原體；操作簡便，單次樣品檢測時間不超過2 h。Balamurugan V 等［17］比較了 FQ－PCR 與 傳統(tǒng)PCR的CPV檢測效率，結(jié)果證明，兩者對于病原體的檢測都是特異性的，然而，與后者相比，前者更為快速與特異，且敏感性是后者的100倍，對于DNA的最低檢測限為0.042pg／反應(yīng)。FQ－PCR不僅可以實時定量檢測病原體，而且還可以用來評估弱毒苗中的含毒量。Kallesh D J等［18］針對CPV保守的DNA pol基因建立了基于Taqman探針FQ－PCR，以此評估單價GPV弱毒苗或GPV與小反芻獸疫病毒（PPRV）二聯(lián)弱毒苗中GPV含量。通過與疫苗產(chǎn)業(yè)中TCID50檢測病毒的傳統(tǒng)方法比較，該FQPCR可以作為一種補充方法應(yīng)用于弱毒苗病毒量的測定。

4 疫苗

目前尚無羊痘特效治療藥物，疫苗免疫是最好的防控措施。某些CPV可作為疫苗株使用，例如0240肯尼亞綿羊和山羊痘株、綿羊用羅馬尼亞株和RM－65株、山羊用Mysore株和Gorgan株等。采用0240株弱毒苗免疫羊后保護力可達1年以上，甚至終身保護。然而，由于CPV的免疫反應(yīng)主要依賴于細胞免疫，而滅活苗誘導(dǎo)機體細胞免疫的能力較弱，所以滅活苗只能對羊群提供短暫保護［9］。所以，大多數(shù)國家采用弱毒苗防控羊痘，目前全球經(jīng)批準上市的主要CPV疫苗的詳細信息見表2。另外，除了傳統(tǒng)疫苗，基因工程疫苗也正處在研發(fā)當中。例如，利用CPV作為痘病毒載體，基于基因工程技術(shù)將外源目的基因克隆至此載體而制備的新型疫苗可以產(chǎn)生針對兩種疾病的雙重保護。CPV毒力相關(guān)基因和決定宿主范圍基因的鑒定及其特性的研究，將為全面理解宿主與病原之間的相互作用和基因工程疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)［19］。

4.1 滅活苗

以組織培養(yǎng)細胞制備的滅活苗幾乎為裸露的病毒顆粒，作為疫苗接種后不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對由膜包被的病毒顆粒的特異性免疫；另外，滅活苗誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答能力較弱，而CPV的免疫應(yīng)答主要依賴細胞免疫［9］。所以，針對羊痘的滅活苗難以廣泛應(yīng)用，盡管如此，由于滅活苗不存在毒力返強現(xiàn)象，研究者也正致力于羊痘滅活苗的研發(fā)。Awad M等［20］采用SPV埃及株作為滅活疫苗株，經(jīng)二乙烯亞胺（BEI）滅活，動物免疫試驗，制備了羊痘滅活苗。結(jié)果表明，經(jīng)20mL／L BEI滅活7h，病毒完全喪失毒力，將其制備疫苗免疫動物，采用VNT和ELISA檢測到動物免疫1周后體內(nèi)出現(xiàn)特異性抗體，且抗體水平可以維持至第4周。羔羊攻毒試驗結(jié)果表明，該疫苗對羔羊的免疫保護可持續(xù)6個月。趙利平等將GPV GT4－STV42－56種毒在犢牛睪丸細胞上繁殖后收獲毒液，用1mL／L甲醛使其滅活，加適量206佐劑制備了油佐劑滅活苗。將疫苗以不同劑量皮下免疫接種不同種群山羊；免疫接種21d后，用AV40強毒進行攻毒保護試驗。結(jié)果表明，免疫劑量達0.5mL時，疫苗對內(nèi)蒙絨山羊保護率為100%，廣西黑山羊為80%［21］。盡管不同試驗都證明了羊痘滅活苗可以誘導(dǎo)免疫保護，但保護期較弱毒苗短，所以在臨床使用中受到限制。

表2 全球經(jīng)批準上市的CPV疫苗（參考愛荷華州立大學(xué)數(shù)據(jù)庫）Table 2 Licensed CPV vaccines in the world（Referring to Iowa State University database）

4.2 弱毒苗

由表2可知，目前針對羊痘的防控，全球范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的是弱毒苗。相對于滅活苗，弱毒苗帶來的免疫保護期更長，而且不僅可以誘導(dǎo)體液免疫，更能誘導(dǎo)細胞免疫；因為CPV的免疫反應(yīng)主要為細胞免疫，所以弱毒苗對羊痘的免疫更為重要。Bhanuprakash V等［22］采用在次級羔羊睪丸細胞經(jīng)50次傳代的SPV Ranipet株制備了SP弱毒苗，TCID50和RD50值分別為109.63／mL和109.51／mL；以102TCID50／只的劑量免疫接種660只綿羊，免疫接種后6個月期間隨機挑選試驗個體進行葡萄糖利用試驗和血清中和試驗。結(jié)果表明，該疫苗對免疫動物無毒副作用，并能較理想地誘導(dǎo)細胞免疫和體液免疫。除了羊痘，小反芻獸疫（PPR）同樣對羊具有較大威脅，CPV與PPRV二聯(lián)弱毒苗可以起到對二者的防控作用。為了評估此種疫苗的安全性與免疫原性，Hosamani M 等［23］以1mL／只的劑量（CPV和PPRV含量皆為103TCID50）免疫試驗山羊，并采用ELISA在免疫后4周內(nèi)檢測動物機體中抗體水平；免疫28d后攻毒，經(jīng)免疫的山羊可以抵抗CPV與PPRV，而對照組出現(xiàn)明顯臨床癥狀。試驗表明，此二聯(lián)苗的效力與安全性較高，且沒有CPV與PPRV互相免疫干擾的現(xiàn)象。

4.3 基因工程苗

CPV基因組相對較大，可以作為載體表達多個外源基因，且處于CPV基因組非編碼區(qū)的外源基因既不影響其復(fù)制也不會破壞CPV抗原蛋白的表達，所以其可作為其他病源基因的表達載體生產(chǎn)基因工程疫苗。OIE于2011年在其官方網(wǎng)站上宣布牛瘟（Rinderpest）已在全球范圍內(nèi)根除，這一結(jié)果得益于眾疫病區(qū)多年來對牛瘟的有效防控。Romero C H等［24］將含有牛瘟病毒（RPV）RBOK疫苗株完整H基因的cDNA克隆，在痘苗晚期啟動子P11的控制下，通過同源重組插入到CPV KS－1株的胸苷激酶基因中，從而構(gòu)建了可以表達RPV H蛋白的重組痘病毒。這種重組病毒可在經(jīng)免疫的牛體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的RPV中和抗體，經(jīng)此CPV異源強毒株的人工感染試驗證明，其可對實驗動物產(chǎn)生免疫保護。Berhe等構(gòu)建了一個含有PPRV F蛋白cDNA的重組CPV，并且快速有效地篩選了高純度的重組病毒克隆。動物試驗證明，其對山羊抗PPRV的最低免疫保護劑量為0.1pfu。除了痘病毒載體的應(yīng)用，CPV還可以作為用以區(qū)分免疫動物和自然感染動物標記疫苗的載體。Chen W等［25］構(gòu)建了兩個分別表達PPRV H和F蛋白的重組CPV，即CPV－H和CPV－F。不同劑量的重組體免疫試驗證明，前者誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的能力強于后者；重組病毒經(jīng)皮下免疫便可產(chǎn)生高水平的PPRV中和抗體，經(jīng)免疫的綿羊和山羊，80%以上體內(nèi)的中和抗體可持續(xù)6個月；而且，CPV－H可以給山羊帶來抗PPRV和CPV的雙重保護。另外，由于重組疫苗只含有PPRV的一種糖蛋白，所以，如果伴有特異性血清學(xué)診斷方法，此重組疫苗可以作為標記疫苗應(yīng)用于PPR流行病學(xué)調(diào)查。

5 結(jié)語

隨著各國貿(mào)易的頻繁往來，CPV現(xiàn)已不僅僅只流行于亞非各地，歐洲等地偶爾也有羊痘的暴發(fā)。各國建立規(guī)范的對外動物貿(mào)易制度并加強對羊痘的防控將對避免疫病大規(guī)模暴發(fā)起到關(guān)鍵作用。對CPV不同分離株抗原性和基因組特性的研究，尤其針對P32蛋白，將為研制新的血清學(xué)診斷試劑奠定良好的基礎(chǔ)，快捷敏感的FQ－PCR將更多地應(yīng)用于臨床大批量的樣品檢測。目前至將來一段時間，預(yù)計弱毒苗還將是防控羊痘的首選疫苗制品。然而，安全有效的基因工程苗研制越來越引起人們的重視，尤其CPV作為載體，在重組痘病毒疫苗，特別是標記疫苗等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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