廣東省豬圓環(huán)病毒2型感染的血清學(xué)調(diào)查

徐廷川，王 衡，張得玉，張桂紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）引起的單獨或繼發(fā)／混合感染其他致病微生物的一系列疾病的總稱，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、新生仔豬先天性震顫（Congenital tremors，CT）、豬增生性壞死性間質(zhì)性肺炎（Interstitial pneumonia，IP）以及懷孕母豬的繁殖障礙等［1］。PCV－2、豬繁殖與呼吸道綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）的混合感染已經(jīng)成為PMWS陽性豬的主要致病因素，以兩病毒混合感染的比例很高，在德國高達(dá)75.9%，美國60%［2］，中國30%左右［3］。近年來，該病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，在引起免疫抑制的同時，還容易繼發(fā)、并發(fā)一系列疾病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，已成為豬群的又一重要免疫抑制?。?］。為了解廣東省豬PCV－2的感染及與PRV或PRRSV混合感染情況，在2007年—2011年，采用PCV－2ELISA診斷試劑盒對該地區(qū)豬血清PCV－2抗體進(jìn)行了檢測，并對該病毒與高致病性與低致病性PRRSV、PRV等混合感染情況進(jìn)行了相關(guān)調(diào)查，旨在了解廣東省PCV－2的感染情況，為廣東省防控PCV－2的感染，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1豬血清和病料樣本收集 分別在江門、佛山、惠州、深圳、肇慶等地區(qū)隨機(jī)選擇15個豬場（均未免疫商品化豬圓環(huán)病毒疫苗），對選定的豬場采用分層隨機(jī)抽樣方法，按5%的比例隨機(jī)采集不同年齡段的豬的血清。從豬耳靜脈或前腔靜脈采血，分離血清，4℃保存?zhèn)溆?。采集送檢疑似PCV－2豬的脾、肺、腎、肝、淋巴結(jié)等組織，研磨后，置－20℃保存?zhèn)溆谩CV－2、PRV、PRRSV陽性對照株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病研究室分離并保存。

1.1.2 試劑盒 PCV－2抗體檢測試劑盒購于武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司；gpI－PRV抗體檢測試劑盒購于武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司；PRRSV抗體檢測試劑盒購于北京IDEXX元亨生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 DNA抽提試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA酶抑制劑（Ribonuclease inhibitor）、TaqTMDNA 聚合酶、dNTP Mixture（2.5and 10mmol／L）、DNA Marker DL 2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑，如氯仿、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測 將采集的各豬場的血清進(jìn)行PCV－2抗體檢測，檢測PCV－2、PRV、PRRSV抗體具體操作及結(jié)果判定按說明書進(jìn)行。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表PCV－2核苷酸全序列（AY188355）、PRRSV核苷酸全序列（AY032626）、PRV 核苷酸全序列（BK001744）分別設(shè)計一對特異性引物［5－7］（表1）。

1.2.3 抗原檢測 送檢病料研磨后按上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司試劑盒說明書提取病毒DNA，參照Invitrogen公司的Trizol試劑說明書提取病毒RNA。

應(yīng)用相應(yīng)的 PCV－2、PRV、PRRSV 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25μL體系：10×PCR buffer（Mg2＋Plus）2.5μL；dNTP（2.5mmol／L）2.5μL；上、下游引物（25pmol／μL）各0.25μL，TaqTM DNA 聚合酶0.25μL，DNA／cDNA 2μL，滅菌雙蒸水17.25 μL。PCV－2PCR擴(kuò)增條件為：95℃3min后，按94℃45s，54℃40s，72℃1min，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min；PRV PCR擴(kuò)增條件為：95℃4 min后，按94℃40s，53℃40s，72℃1min，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min；PRRSV PCR擴(kuò)增條件為：94℃5min后，按94℃45s，50℃30s，72℃50min，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物5μL，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4 統(tǒng)計分析 材料中所有數(shù)據(jù)均用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。不同生長階段、不同地區(qū)PCV－2陽性率均采用卡方檢驗，PCV－2感染與PRRSV和PRV免疫應(yīng)答率進(jìn)行相關(guān)性分析，PCV－2感染率與PRRSV感染率之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

表1 PCV－2、PRRSV和PRV引物序列Table 1 Primer sequence of PCV－2、PRRSV and PRV

2 結(jié)果

2.1 豬場及豬群的PCV－2陽性率

對來自廣東省15個豬場2007年—2011年764份血清樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有被檢測豬場均存在PCV－2感染，豬場的抗體陽性率為100%（15／15），全部豬的PCV－2平均抗體陽性率為61.91%（473／764）（表2）。

2.2 不同年齡段豬的PCV－2抗體陽性率

種公豬的PCV－2抗體陽性率為70.97%（22／31），經(jīng)產(chǎn)母豬的抗體陽性率為67.29%（72／l07），后備母豬的抗體陽性率為64.81%（35／54），斷奶仔豬的抗體陽性率為59.52%（322／541）。對種公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和斷奶仔豬進(jìn)行卡方分析，發(fā)現(xiàn)不同生長階段豬的PCV－2抗體陽性率差異極顯著（P＜0.01）。進(jìn)行趨勢卡方檢驗發(fā)現(xiàn)PCV－2的抗體陽性率隨著年齡增長而升高，并且相關(guān)性顯著（P＜0.01）（表3）。

2.3 部分豬場PRV和PRRSV抗體檢測結(jié)果

PRV檢測是采用PRV gpI抗體檢測試劑盒，可以區(qū)分野毒感染和疫苗免疫抗體。由結(jié)果可知，PCV－2的感染率和PRV的感染率息息相關(guān)，不僅能引起豬繁殖障礙性疾病，同時也是引起豬呼吸道疾病綜合征的主要原發(fā)病因，PCV－2陽性率高的豬場，PRV的陽性率也很高。PCV－2陽性的豬群PRRSV抗體陽性率也很高，這可能與豬場主動免疫有關(guān)，也有可能是豬場曾經(jīng)或正在感染PRRSV（表4）。

表2 不同豬場豬群的PCV－2抗體檢測Table 2 Antibody positive rate of different pig farms

表3 不同生長階段豬的PCV－2抗體檢測Table 3 Detection results of PCV－2antibody from different growth phases of pigs

表4 部分豬場PRV和PRRSV抗體檢測Table 4 Detection results of PRV and PRRSV antibodies from part of pig farms

2.4 部分豬場PCV－2、PRV和PRRSV檢測結(jié)果

PCV－2、PRV、PRRSV 病原檢測采 用特異性PCR方法，結(jié)果見表5。由檢測結(jié)果可見，總共檢測豬頭數(shù)為238頭，其中PCV－2陽性率為75.21%（179／238），與 PRV 混合感染陽性率為14.71%（35／238），與 PRRSV 混合感染陽性率為47.48%（113／238），PCV2、PRRSV 和 PRV 三者混合感染的陽性率為8.82%（21／238）。PRRSV 陽性中71頭是變異株感染，變異株占PRRSV陽性感染的62.83%（71／113）。

表5 部分豬場PCV－2、PRV和PRRSV病原檢測Table 5 Detection results of in PCV－2，PRV and PRRSV in part of pig farms

2.5 PCV－2、PRV、PRRSV擴(kuò)增結(jié)果

從2007年－2011年采集的部分組織樣品中檢測PCV－2、PRRSV、PRV，其PCR擴(kuò)增片段大小分別為651、596、267bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 部分樣品PCV－2（A）、PRRSV（B）、PRV（C）電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCV－2（A）、PRRSV（B），PRV（C）PCR products in part of samples

3 討論

全世界許多國家和地區(qū)的豬群中都存在著PCV－2，但其流行情況不盡相同。此次檢測的我國廣東省15個豬群，既有國外引進(jìn)的純種豬，也有國內(nèi)種豬；既有斷奶仔豬，又有后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬，因而具有一定代表性。本研究中被檢測豬場均存在PCV－2感染，PCV－2的總抗體陽性率為61.91%（473／764），這與郎洪武等［8］報道的全國7個養(yǎng)豬大省42.9%的總陽性率相比，要高出19個百分點；較趙東升等［9］報道的全國（2002年－2007年）PCV－2血清抗體總陽性的平均水平38.47%要高出23.4個百分點。表明廣東被調(diào)查地區(qū)的PCV－2感染已經(jīng)較普遍，可能與引種不規(guī)范、飼養(yǎng)管理水平低下等方面原因有關(guān)，需要引起高度重視。

調(diào)查結(jié)果表明，受檢豬群斷奶仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬的PCV－2感染陽性率較高。由此推測，豬群中PCV－2感染比例隨著豬生長日齡的增加而升高，與郎洪武等［8，10－11］報道的結(jié)果相似。

近年來，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的不斷發(fā)展，在豬群中存在PCV－2、PRRSV、PRV及豬附紅細(xì)胞體等病原的感染，且混合感染比較普遍，對養(yǎng)豬業(yè)造成的危害正日益加?。?2－13］。本研究對所有 PCV－2抗體陽性血清樣品與PRV及PRRSV混合感染的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，存在PRRSV（47.48%）、PRV（14.71%），這與萬根等［14－15］報道的 PCV－2抗體陽性率均不同程度地存在PRRSV（43.75%）、PRV（17%～19%）相一致，其相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過對來自廣東省的豬血清樣本和病料樣品進(jìn)行PCV－2抗體和其他病原混合感染的檢測，系統(tǒng)分析了PCV－2在豬群中的感染及流行規(guī)律，為開展PCV－2所致疾病的診斷與防控奠定了基礎(chǔ)。

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