表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型ORF2和豬IFN-γ基因重組腺病毒的免疫保護(hù)作用

裴黨帥,鄭念廣,唐明森,夏 芳,陳瑞愛,,羅滿林,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642;2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興 527400)

表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型ORF2和豬IFN-γ基因重組腺病毒的免疫保護(hù)作用

裴黨帥1,鄭念廣1,唐明森1,夏 芳2,陳瑞愛1,2,羅滿林1,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642;2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興 527400)

本研究以構(gòu)建的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF2和豬IFN-γ重組腺病毒(簡稱rAd-OI)為免疫原免疫30日齡、母源抗體為陰性的三元雜商品仔豬。25頭豬隨機(jī)分為5組,每組5頭。A組肌注免疫rAd-OI 106.12TCID50/頭,B組肌注免疫rAd-OI 107.12TCID50/頭,C組肌注免疫rAd-OI 108.12TCID50/頭,D組肌注免疫rAd-OI 109.12TCID50/頭,E組不作免疫,留作攻毒對照。一免后21 d進(jìn)行二免,二免后21 d進(jìn)行第3次免疫,免疫后每周采血檢測抗體水平。免疫后56 d(即第三次免疫后14 d)所有豬攻毒PCV-2,劑量為5×105.67TCID50/頭。攻毒前后每周采血檢測抗體水平及病毒血癥情況。攻毒21 d后處死所有豬,檢測組織中的病毒含量。結(jié)果顯示C組的抗體水平一直顯著高于其他各組,攻毒后的病毒血癥也低于其他各組。結(jié)合抗體水平、免疫和攻毒后的臨床癥狀以及病毒血癥水平得出,C組的免疫劑量較為理想,此結(jié)果為PCV-2 ORF2及豬IFN-γ重組腺病毒疫苗的生產(chǎn)開發(fā)提供了理論依據(jù)。

PCV-2 ORF2和豬IFN-γ重組腺病毒;免疫保護(hù);抗體測定

PCV(Porcine circovirus,PCV)在分類學(xué)上屬于圓環(huán)病毒科,是一種小的、無囊膜的、環(huán)狀單股DNA病毒,直徑平均為17nm,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒。根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差異,PCV被劃分成無致病性PCV-1(Porcine circovirus type 1,PCV-1)和致病性PCV-2(Porcine circovirus type 2,PCV-2)兩個(gè)基因型。PCV-2病毒基因組全長1 767或1 768個(gè)核苷酸[1-3],共編碼11個(gè)開放閱讀框架ORF(open reading frames,ORFs),其中 ORF1、ORF2是兩個(gè)最大的閱讀框,ORF1編碼與復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白,ORF2編碼衣殼蛋白Cap蛋白。PCV-2 DNA以滾環(huán)方式復(fù)制,ORF1與ORF2間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)AA GTA TTAC為其復(fù)制起點(diǎn)[4]。兩基因型之間ORF1比較保守,同源性為 83%,ORF2同源性為67%～70%。

PCV-2被認(rèn)為是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemiac wasting syndrome,PMWS)的原發(fā)性病原,后來發(fā)現(xiàn)PCV-2還與豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、先天性震顫(Congenital termors,CT)、后期流產(chǎn)(Late-term abortions)和滲出性皮炎(Exudative epidermitis)等疾病密切相關(guān),統(tǒng)稱為PCV-2相關(guān)疾病。其主要臨床表現(xiàn)為消瘦、生長遲緩、皮膚蒼白、黃疸、呼吸困難和腹瀉等,目前已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)及世界養(yǎng)豬業(yè)的重要免疫抑制性疾病之一[5-6]。1991年加拿大首次爆發(fā)PMWS,隨之PCV-2迅速在北美洲、南美洲、歐洲、亞洲、大洋洲和非洲的各個(gè)養(yǎng)豬國家蔓延。目前我國PCV-2感染已相當(dāng)嚴(yán)重,全國各大小豬場均存在PCV-2感染[7],PCV-2已經(jīng)成為阻礙當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病原之一。疫苗免疫作為防控PCV-2的主要手段,已成為國內(nèi)外學(xué)者專家關(guān)注的熱點(diǎn)。目前,國內(nèi)外已有PCV-2滅活疫苗及亞單位疫苗注冊上市,但其免疫效果還有待進(jìn)一步提高[8-9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,活載體疫苗、核酸疫苗等新型疫苗正在積極研究中,成為目前主要研究的熱點(diǎn)。腺病毒載體是目前應(yīng)用比較廣泛的載體,由于其宿主范圍廣、感染性強(qiáng)、安全性高、外源病毒能游離表達(dá)等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于制藥、基因工程疫苗、基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域。Wang X等[10]以PCV-2 ORF2為目的基因,構(gòu)建出了重組腺病毒rAd-Cap。免疫小鼠后,用間接ELISA、Western blot及病毒中和試驗(yàn)均可在免疫鼠血清中檢測到PCV-2 ORF2抗體。用rAd-Cap免疫仔豬后也能檢測到ELISA抗體及病毒中和抗體;攻毒后,免疫豬有短暫的發(fā)熱,發(fā)熱時(shí)間較攻毒對照組短,無其他明顯的臨床癥狀。聞曉波等[11]以構(gòu)建好的PCV-2大慶分離株質(zhì)粒pMD-18T/PCV-2為模板,PCR分別擴(kuò)增去掉核定位信號肽的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和 Rep蛋白基因(ORF1),將其串聯(lián)克隆到原核表達(dá)載體pET 30α(+)上,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pET 30α-ORF2/ORF1,轉(zhuǎn)化E.coliBL 21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行 SDS-PAGE電泳與Western blot分析,純化后的重組蛋白與PCV-2陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),并能與免疫小鼠的抗血清發(fā)生特異性反應(yīng),說明重組蛋白具有較好的免疫學(xué)活性。劉根梅等將PCV-2 ORF2基因擴(kuò)增后進(jìn)行T/A克隆,亞克隆至腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV,構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-ORF2,經(jīng)PCR方法和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及測序鑒定后,經(jīng)PmeI酶切線性化,在BJ 5183細(xì)菌中與腺病毒骨架載體pAD Easy-1同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAD-CMV-ORF2,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)移AD-293細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝和擴(kuò)增,成功構(gòu)建了重組腺病毒rAD-CMV-ORF2,免疫接種小鼠后產(chǎn)生了較高的抗體水平[12]?？梢?重組腺病毒免疫能夠顯著減輕免疫豬的病理變化及病毒血癥,是有效的PCV-2候選疫苗。本研究在前人工作的基礎(chǔ)上,以廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司研發(fā)中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的rAd-OI為免疫原免疫30日齡仔豬,以檢測rAd-OI的免疫效果,以期對rAd-OI疫苗的研發(fā)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

rAd-OI為廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司研發(fā)中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,PCV-2分離自臨床表現(xiàn)為PMWS的仔豬腹股溝淋巴結(jié),PK-15細(xì)胞、AD-293細(xì)胞為廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司研發(fā)中心提供。

病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒為Takara公司產(chǎn)品。質(zhì)粒抽提試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。熒光定量 PCR試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。PCV-2 ELISA抗體檢測試劑盒為武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司產(chǎn)品,7500 Fast Real-Time PCR System為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)用動(dòng)物分組及免疫方案 25頭三元雜仔豬購自廣東省新興縣,PCV-2母源抗體檢測為陰性。實(shí)驗(yàn)豬隨機(jī)分為5組,每組5頭。A組肌注rAd-OI 106.12TCID50/頭,B組肌注 rAd-OI 107.12TCID50/頭,C組肌注rAd-OI 108.12TCID50/頭,D組肌注rAd-OI 109.12TCID50/頭,E組不作免疫,留作攻毒對照。一免后21 d進(jìn)行二免。二免21 d后進(jìn)行第三次免疫。免疫后每周采血檢測抗體水平。免疫后56 d(即第三次免疫14 d)所有組攻毒PCV-2,劑量為5×105.67/頭。攻毒前后每周采血檢測抗體水平及病毒血癥情況,觀察豬只的臨床反應(yīng)情況。攻毒21 d后處死所有豬,檢測組織中的病毒含量。

1.2.2 病毒擴(kuò)增及PCV-2 TCID50的測定 采集的病料研磨后反復(fù)凍融 3次,離心吸取上清液經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾后接種 PK-15細(xì)胞,接毒后24 h用300 mmol/L的D-氨基葡萄糖作用細(xì)胞30 min,加足維持液繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h后收毒。擴(kuò)增得到的PCV-2用PCR方法進(jìn)行全基因擴(kuò)增,將擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)純化回收后連接pMD 18-T載體,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后抽提質(zhì)粒,進(jìn)行菌液及質(zhì)粒的PCR檢測,并將PCR陽性的菌液送至Invitrogen公司進(jìn)行測序鑒定,具體方法參考文獻(xiàn)[13]。PCV-2 TCID50的測定按照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行,按Reed與Muench氏法計(jì)算病毒TCID50。

AD-293細(xì)胞用于擴(kuò)增 rAd-OI。待細(xì)胞長至80%左右滿時(shí),加入病毒液37℃孵育1 h,加足營養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h收毒。

1.2.3 免疫前后抗體水平監(jiān)測 免疫前1 d采血,免疫后每周采血,監(jiān)測抗體消長規(guī)律?？贵w的檢測按照豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的方法進(jìn)行。

1.2.4 熒光定量PCR方法檢測病毒血癥水平

1.2.4.1 熒光定量PCR檢測方法的建立 以PCV-2為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增ORF2,將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pMD 18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在氨芐(Amp)抗性平板上篩選陽性克隆;在含Amp的 LB肉湯中震蕩培養(yǎng)過夜,用DNA提取試劑盒提質(zhì)粒,經(jīng)PCR檢測、雙酶切檢測陽性的質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒。標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒用分光光度計(jì)測定濃度后換算為拷貝數(shù),經(jīng)10倍倍比稀釋在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng),得出各自的反應(yīng)曲線,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。并對該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行檢測,具體方法可參考文獻(xiàn)[15]。

熒光定量PCR檢測方法的反應(yīng)體系為:Super Mix-UDG 12.5 μ L,上 下 游引 物 各 1.5 μ L,探 針0.5 μ L,Rox 校正染料 0.5 μ L,DNA 模板 2.0 μ L,ddH2O 6.5 μ L, 總體積為 25 μ L 。

反應(yīng)程序?yàn)?55℃,2 min;95℃,2 min;95℃,3 s;60℃,30 s,40個(gè)循環(huán)。

1.2.4.2 血清和組織中病毒含量的測定 取200μ L清亮無溶血的血清用病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒提取DNA,以提取的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),檢測其中的病毒含量。

稱取肺臟、腹股溝淋巴結(jié)0.05 g,充分研磨后用500μ L滅菌PBS溶解,反復(fù)凍融3次,12 000 r/min離心5 min,取200 μ L 上清液提取DNA,以提取的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),檢測其中的病毒含量。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

各組豬在攻毒前體溫都處于正常范圍,攻毒后免疫組體溫略有上升,但不明顯。攻毒對照組有兩頭體溫上升較高,攻毒后7 d時(shí)高達(dá)41.5℃。與免疫保護(hù)組相比,攻毒對照組明顯消瘦,各組均未出現(xiàn)黃疸及神經(jīng)癥狀。

2.2 試驗(yàn)豬抗體消長情況

由表1可知,免疫組A在免疫后21 d抗體明顯上升,免疫42 d后抗體達(dá)到陽性水平;免疫組B在免疫后28 d抗體明顯上升,免疫35 d后抗體達(dá)到陽性水平;免疫組C在免疫后21 d抗體明顯上升,免疫35 d后抗體達(dá)到陽性水平;免疫保護(hù)組D在免疫后21 d抗體明顯上升,免疫35 d后抗體達(dá)到陽性水平;攻毒對照組在攻毒前抗體無顯著變化,攻毒刺激后抗體有所上升。

2.3 剖檢處死病變

所有豬在攻毒后21 d處死,觀察病變。攻毒對照組可見肺臟大面積充血、壞死(圖1E);腹股溝淋巴結(jié)腫大、壞死(圖 1F);脾臟出血,邊緣梗死(圖1G);腎臟有白色點(diǎn)狀壞死(圖1H)。

2.4 組織病理學(xué)變化

試驗(yàn)豬處死后采集病料做組織切片觀察病理變化。免疫保護(hù)組肺組織結(jié)構(gòu)完整,未見病理變化(圖2A)。腹股溝淋巴結(jié)未見明顯病理變化(圖2B)。脾臟結(jié)構(gòu)完整,無明顯病理變化(圖2C)。腎臟結(jié)構(gòu)正常(圖2D)。攻毒對照組肺臟間質(zhì)增寬,肺泡壁增寬,毛細(xì)血管腔擴(kuò)張充血(圖2E),淋巴細(xì)胞浸潤(圖2F)。淋巴結(jié)淋巴濾泡結(jié)構(gòu)缺失,淋巴細(xì)胞排列疏松(圖2G)。間質(zhì)性腎炎,腎小管間淋巴細(xì)胞浸潤(圖2H)。

2.5 病毒血癥情況

2.5.1 試驗(yàn)豬攻毒前后血清中的病毒含量

由表 2可知,攻毒后 3、7、14、21 d,C 組的病毒含量均明顯低于其他各組。隨著攻毒后時(shí)間的延長,各組的病毒含量均逐漸下降,且仍以C組的下降最為顯著。

2.5.2 試驗(yàn)豬處死后臟器含毒情況

由表3可知,C組的病毒含量顯著低于其他各組。說明C組的免疫劑量能夠有效減少攻毒對豬體的侵害。

表1 試驗(yàn)豬抗體消長情況Table 1 The g rowth and decline of antibody level

圖1 試驗(yàn)豬剖檢病變Fig.1 The pathological lesions of piglets

圖 2 試驗(yàn)豬組織病理學(xué)變化(HE 40×)Fig.2 The histopathological lesions of piglets

表2 試驗(yàn)豬攻毒前后血清中的病毒含量Table 2 The content of virus in serum of piglets before and after challenge

表3 試驗(yàn)豬處死后臟器含毒情況Table 3 T he content of virus in tissues of piglets

3 討論

目前,PCV-2滅活疫苗主要有Merial公司研制的全病毒滅活疫苗Circovac,及Fort Dodge公司研制的PCV1-2嵌合全病毒滅活疫苗Suvaxyn PCV-2 one dose,滅活疫苗具有無毒、安全、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),但對機(jī)體刺激時(shí)間比較短,需多次接種,且效果并不十分理想,而且PCV-2在細(xì)胞上的增殖滴度低,也給其制備生產(chǎn)增加了成本。國外已注冊的亞單位疫苗主要有Intervet公司研制的Porcilis PCV及Boehringer-Ingelhein公司的CircoFLEX。兩者均為桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白亞單位疫苗,兩劑量的Porcilis PCV及單劑量的CircoFLEX免疫3周齡及以上商品豬,均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的伴有中和抗體的體液免疫反應(yīng),能減輕病毒血癥,減少淋巴結(jié)組織損傷及PCV病毒載量[8]。但是表達(dá)亞單位Cap蛋白的桿狀病毒需用昂貴的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),因而這些疫苗的生產(chǎn)成本較高,而且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答主要為體液免疫,忽視了細(xì)胞免疫應(yīng)答在PCV-2保護(hù)免疫中的作用[16]。Fenaux M 等[17]用 PCV-2的 ORF2替換PCV-1的ORF-2,成功構(gòu)建減毒的嵌合PCV1-2,免疫SPF仔豬42 d后,大部分免疫豬血清中PCV Cap蛋白抗體均發(fā)生陽轉(zhuǎn),攻毒21 d后在所有免疫豬均未檢查到病毒血癥,淋巴結(jié)腫大及衰竭明顯減輕,淋巴結(jié)中病毒DNA及抗原量較對照組顯著減少,且抗體陰性豬對PCV-2也具有相當(dāng)?shù)牡挚沽?表明細(xì)胞免疫在保護(hù)性免疫方面具有重要的作用。減毒活病毒疫苗雖然能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,但該疫苗的長期使用存在返強(qiáng)的危險(xiǎn),且增殖能力較低。

本研究中所用的攻毒毒株分離自臨床表現(xiàn)為PMWS的仔豬,病料采集后經(jīng)PCV-2特異性引物PCR檢測為陽性,陽性病料接種PK-15細(xì)胞后擴(kuò)增至第10代時(shí)仍能在細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測到病毒。由于PCV-2在PK-15細(xì)胞上不會(huì)產(chǎn)生肉眼可見的細(xì)胞病變,本研究對擴(kuò)增出來的病毒液進(jìn)行了間接免疫檢測,具體方法參考文獻(xiàn)[14],結(jié)果檢測到了特異性的綠色熒光,說明病毒得以擴(kuò)增。擴(kuò)增出的病毒按間接免疫熒光方法和PCR方法分別測定其TCID50,兩者得出的結(jié)果分別為10-5.62/0.1 mL和10-5.67/0.1 mL,兩者差異不顯著(P＞0.05)。擴(kuò)增出的病毒經(jīng)純化后按5 mL/頭肌肉注射30日齡健康仔豬,未出現(xiàn)明顯癥狀,但明顯消瘦,剖檢可見腹股溝淋巴結(jié)明顯腫大,其他器官均正常。采集全血和腹股溝淋巴結(jié)、肺等臟器,經(jīng)PCR檢測均為陽性,經(jīng)熒光定量PCR檢測病毒含量顯著高于對照組(P＜0.05)。

本研究以不同劑量的rAd-OI作為免疫原免疫30日齡三元雜仔豬,用ELISA方法檢測抗體消長情況,用熒光定量PCR方法檢測免疫、攻毒及剖檢后血清、臟器中的病毒含量,并對剖檢所得組織制作病理組織學(xué)切片以觀察各組織的病變情況。為了獲得較高的抗體值,本試驗(yàn)共進(jìn)行了三次免疫,每次免疫間隔21 d。結(jié)果表明,各免疫組在首免后42 d均達(dá)到了抗體陽性水平,且以C組抗體水平為最高,攻毒對照組在攻毒前抗體無顯著變化。在實(shí)際生產(chǎn)中,只需進(jìn)行兩次免疫即可達(dá)到陽性。攻毒后在PCV-2的刺激下,各組的抗體均有明顯的增加,攻毒對照組的抗體也達(dá)到了陽性標(biāo)準(zhǔn),但仍以C組的抗體水平為最高。在病毒血癥監(jiān)測方面,攻毒后3、7、14、21 d以及處死后,免疫組C組的病毒含量都明顯低于攻毒對照組。在攻毒后的臨床癥狀、大體病變和組織病變方面,免疫組整體上也優(yōu)于攻毒對照組。綜合抗體水平、臨床癥狀以及病毒血癥水平,可以得出C組的免疫劑量較為合理。以上結(jié)果均說明,rAd-OI活病毒作為免疫原能夠有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,減輕病毒血癥,減少PCV-2對臟器組織的損傷,降低組織器官的病毒含量。今后我們還將致力于研究rAd-OI對機(jī)體細(xì)胞免疫的影響,探討rAd-OI免疫后各類細(xì)胞因子的變化情況。此外,還將探討rAd-OI活病毒疫苗、rAd-OI滅活疫苗以及其他種類PCV-2疫苗的免疫效果差異。總之,本研究作為rAd-OI疫苗研制的前期臨床性試驗(yàn),為PCV-2疫苗的研發(fā)和豬圓環(huán)病毒病的防控奠定了基礎(chǔ)。

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[17]Fenaux M,Opriessnig T,Halbur P G,et al.A chimeric porcine circovirus(PCV)with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV ty pe 2(PCV2)cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs[J].J Virol,2004,78(12):6297-6303.

Immunological Protection of Recombinant Adenovirus Expressing PCV-2 ORF2 and IFN-γGene

PEI Dang-shuai1,ZHENG Nian-guang1,TANG Ming-sen1,XIA Fang2,CHEN Rui-ai1,2,LUO Man-lin1,2

(1.South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China;2.Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co.,Ltd,Xinxing,Guangdong,527400,China)

In this study,30 day-old,three-way cross merchandise piglets of maternal antibody negative were inoculated with the established recombinant adenovirus expressing PCV-2 ORF2 and porcine IFN-gamma gene.25 piglets were randomly divided into 5 groups of five piglets.Different doses of recombinant viruses were immunized through muscle injection,group A with 106.12TCID50,group B with 107.12TCID50,group C with 108.12TCID50,group D with 109.12TCID50,group E were not immunized,as for challenge control.The boost immunization was after 21 days of the first immunization.The third immunization was after 21 days of the boost immunization.In order to detect antibody level,the sera of piglets were collected weekly since the first immunization.After 56 days of the first immunization(after 14 days of the third immunization),all piglets were challenged with PCV-2,in 5×105.67TCID50.Before and after challenge,the sera of piglets were collected weekly for detecting antibody level.21 days after the challenge,all piglets were killed for Detecting virus contents of tissues.The results showed that the antibody levels of group C were significantly higher than that of other groups,and its viremia levels were also lower than that of others.The dose of group C was reasonable according to the antibody levels,clinical manifestation and viremia levels.The results provided theoretical basis for research and development of recombinant adenovirus expressing PCV-2 ORF2 and porcine IFN-γGene.

PCV-2 ORF2 and porcine IFN-recombinant adenovirus for detecting;immunological protection;antibody level;viremia

S852.659.2

A

1007-5038(2011)07-0033-06

2011-03-11

廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司科研項(xiàng)目(033A201005-3)

裴黨帥(1984-),男,陜西興平人,碩士研究生,主要從事家畜傳染病學(xué)研究。*通訊作者

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