四個(gè)綿羊品種MHC-DQA1基因exonⅡ多態(tài)性分析*

李 敏,任艷玲,肖 娜,董文艷,沈志強(qiáng),*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;3.山東省洼地綿羊繁育技術(shù)研究推廣中心,山東濱州 256600)

四個(gè)綿羊品種MHC-DQA1基因exonⅡ多態(tài)性分析*

李 敏1,任艷玲2,3,肖 娜1,董文艷1,沈志強(qiáng)1,2,3*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;3.山東省洼地綿羊繁育技術(shù)研究推廣中心,山東濱州 256600)

為了比較和揭示洼地綿羊、杜泊羊、小尾寒羊及特克賽爾綿羊4個(gè)綿羊品種MHC-DQA1基因的遺傳多態(tài)性,采用PCR-RFLP技術(shù)對4個(gè)綿羊品種224個(gè)樣本的MHC-DQA1基因exonⅡ的315 bp片段進(jìn)行多態(tài)性分析;并對基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì),運(yùn)用Popgen32軟件計(jì)算相應(yīng)的遺傳參數(shù)。結(jié)果表明,AluI-RELP檢測的4個(gè)綿羊品種224只群體中,出現(xiàn)3種基因型MM 、MN、NN,其中N為優(yōu)勢等位基因,且MM基因型只分布于洼地綿羊中。遺傳參數(shù)分析表明,除小尾寒羊外,洼地綿羊、杜泊羊及特克賽爾羊AluI-RELP位點(diǎn)雜合度均高于純合度;且洼地綿羊表現(xiàn)中度多態(tài),其他綿羊品種表現(xiàn)低度多態(tài)。4個(gè)綿羊品種224只群體MHC-DQA1基因exonⅡ在AluI-RELP位點(diǎn)具有較低的遺傳多樣性。

洼地綿羊;杜泊羊;小尾寒羊;特克賽爾;MHC-DQA1;PCR-RFLP;遺傳多態(tài)性

綿羊的MHC稱為OLA(ovine lymphocyte antigen),位于綿羊第20號染色體上,其Ⅱ區(qū)與人類相似,區(qū)域內(nèi)的DR和DQ兩個(gè)基因家族表現(xiàn)豐富的多態(tài)性[4]。綿羊的多態(tài)性更集中在DQ家族[6-7],DQ基因家族有兩個(gè) DQA基因座,即 DQA1和DQA 2基因[5],具有多態(tài)性。綿羊MHC基因數(shù)目和分型研究還不完全,并且該基因座位上的新等位基因數(shù)也在不斷增加。根據(jù)已有的資料Snibson[8]和Zhou等[9]揭示了9個(gè)DQA1和10個(gè)DQA2序列信息;Hickford J G等[10]利用PCR-SSCP方法檢測近2 000只綿羊DQA2基因exonⅡ遺傳多態(tài)性,將DQA2等位基因由10個(gè)增加至23個(gè)。牛和綿羊DQA和DRB的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),其第2外顯子存在著高度多態(tài)性。因此對世界優(yōu)良綿羊品種DQA基因進(jìn)行深入比較分析,將更有助于綿羊抗病育種工作的開展和優(yōu)良綿羊品種的合理開發(fā)與利用。本試驗(yàn)采用PCR-RFLP技術(shù),對4個(gè)綿羊品種MHCⅡ類DQ區(qū)DQA1基因的多態(tài)性進(jìn)行了初步分析,旨在為綿羊的抗病育種研究提供初步的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 洼地綿羊(100只),杜泊羊(50只),小尾寒羊(50),特克賽爾綿羊(24只),頸靜脈采血,ACD抗凝,-20℃凍存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶AluI購于寶生物工程(大連)有限公司,全血 DNA提取試劑盒(T akara,Code D9081)。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 全血DNA提取試劑盒從凍存血樣中提取基因組DNA,置-20℃凍存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)。參照GenBank中公布的綿羊 OLA-DQA1序列,應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物如下:

P1:CCGT TTCACATCTGTGCTGTT

P2:CCCAGTGT TTCAGAAGTGGC

擴(kuò)增片段長度315 bp。

改革開放40年，隨著美劇、韓流、日本動漫等外來文化流入，中國文化價(jià)值觀正發(fā)生深刻變化。廣大青年推崇的西方自由主義和傳統(tǒng)的孝廉文化觀念在很多方面發(fā)生沖突。178年前大英帝國用一場鴉片戰(zhàn)爭撬開了中國大門。今天，中國傳統(tǒng)價(jià)值觀更是受到西方價(jià)值觀的猛烈沖擊。中國優(yōu)秀傳統(tǒng)文化如何傳承發(fā)展成為亟待解決的一個(gè)時(shí)代命題。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 2.5 μ L,dNTP 1.5 μ L,上下游引物各 1 μ L,TaqDNA 聚合酶 0.5 μ L,模板 DNA 1 μ L,補(bǔ) H2O至總體積25 μ L;PCR反應(yīng)條件:95℃5 min,95℃30 s,54℃30 s,72℃30 s,30個(gè)循環(huán);72℃10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產(chǎn)物酶切 分別采用AluI限制性內(nèi)切酶分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。酶切體系為:PCR產(chǎn)物8 μ L,AluⅠ 0.5 μ L,10 ×L buffer 1.5 μ L,補(bǔ)水至15 μ L;37℃,4 h。30 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用POPGEN(Version1.32)計(jì)算分析酶切基因型及其等位基因頻率、雜合度(He)、平均雜合度觀測值(Ho)、多態(tài)信息含量(PIC)等相關(guān)遺傳參數(shù)。

圖1 4個(gè)種綿羊基因組Fig.1 Genomies of four sheep

2 結(jié)果

2.1 4個(gè)綿羊品種全血基因組DNA的提取

全血基因組試劑盒提取的DNA經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1),結(jié)果顯示所提取的DNA質(zhì)量較好,可以作為后續(xù)研究的模板。

2.2 4種綿羊MHC-DQA1基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物對綿羊基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均得到一條315 bp的條帶(圖2)。由圖2可見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小與預(yù)期大小一致,條帶清晰,特異性強(qiáng),適合做 PCR-RELP分析。

圖2 四種綿羊MHC-DQA1基因PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR products of MHC-DQA1 gene in four sheep

2.3 MHC-DQA1基因PCR-RELP多態(tài)性分析

對洼地綿羊、杜泊羊、小尾寒羊及特克賽爾羊等4個(gè)綿羊品種MHC-DQA1基因進(jìn)行AluI-RELP,結(jié)果發(fā)現(xiàn),所檢測的224只綿羊群體MHC-DQA1基因具有多態(tài)性,有M、N兩種等位基因,出現(xiàn)MM(315 bp)、MN(315bp/196 bp/119 bp)、NN(196 bp/119 bp)3種基因型,其中洼地綿羊MHC-DQA1基因進(jìn)行AluI-RELP(圖3);杜泊羊MHC-DQA1基因進(jìn)行AluI-RELP(圖 4);小尾寒羊MHC-DQA1基因進(jìn)行AluI-RELP(圖 5);特克賽爾羊 MHCDQA1基因進(jìn)行AluI-RELP(圖6)。

圖3 洼地綿羊HMC-DQA1基因AluⅠ酶切電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic patterns of HMC-DQA1 gene products digested with AluⅠin Wadi sheep

圖4 杜泊羊HMC-DQA1基因AluⅠ酶切電泳圖譜Fig.4 Electropho retic patterns of MHC-DQA1 gene products digested with AluⅠin Dorper sheep

圖5 小尾寒羊HMC-DQA1基因AluⅠ酶切電泳圖譜Fig.5 Electrophoretic patterns of HMC-DQA1 gene products digested with AluⅠin small tailed han sheep

圖6 特克賽爾羊HMC-DQA1基因AluⅠ酶切電泳圖譜 Fig.6 Electrophoretic patterns of HMC-DQ A1 products digested with AluⅠin texel sheep

2.4 基因型頻率統(tǒng)計(jì)

通過對4個(gè)綿羊品種224只群體MHC-DQA1基因 exonⅡ進(jìn)行 AluI-RELP檢測,發(fā)現(xiàn) MHCDQA1基因酶切等位基因及基因型在4個(gè)綿羊品種中的分布頻率(表1),可以看出MM基因型只分布于洼地綿羊中,小尾寒羊、杜泊羊及特克賽爾羊沒有該基因型存在;除小尾寒羊外,洼地綿羊、杜泊羊及特克賽爾羊AluI-RELP位點(diǎn)雜合度均高于純合度,MN基因型頻率分別為0.53(53)、0.70(35)、0.83(20);NN基因型頻率分別是為 0.37(37)、0.30(15)、0.17(4);在4個(gè)綿羊品種中,N等位基因具有較高的基因頻率(0.58～0.77,平均為0.66),說明N為優(yōu)勢等位基因。

表1 M HC-DQA1基因酶切基因型在不同綿羊品種中的分布頻率Table 1 Genotypic frequencies of AluⅠdigested M HC-DQA 1 gene in four sheep populations

2.5 4個(gè)綿羊品種MHC-DQA1基因遺傳特性分析

由表2可知,所研究的224只綿羊中,AluⅠ-RELP位點(diǎn)雜合度(He)比較高,多態(tài)信息含量(PIC)均比較低。X2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明,洼地綿羊MHC-DQA1基因exonⅡ在AluI酶切位點(diǎn)達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05),但小尾寒羊、杜泊羊及特克賽爾羊未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)。

表2 四個(gè)綿羊品種MHC-DQA1基因PCR-RELP遺傳參數(shù)分析Table 2 Genetic parameters of PCR-RELP of M HC-DQA 1 gene in four sheep populations

3 討論

3.1 MHC-DQA基因作為遺傳標(biāo)記的可行性

綿羊的MHC稱為OLA(ovine lymphocyte antigen),具有高度的多態(tài)性和連鎖不平衡。根據(jù)MHC抗原結(jié)構(gòu)和功能的不同,可將 MHC分為classI基因、classⅡ基因和classⅢ基因3個(gè)區(qū)域,一般認(rèn)為綿羊MHC classⅡ的多態(tài)性和遺傳性,是為了保護(hù)機(jī)體組織對抗疾病的感染。MHC分子分型技術(shù)主要有PCR-RFLP、PCR-SSCP、SNP和克隆測序等,目前家畜MHC-DQA的研究主要集中在牛、綿羊和豬等,牛上發(fā)現(xiàn)了39個(gè)DQA基因,綿羊上發(fā)現(xiàn)了8個(gè)DQA1基因和 16個(gè)DQA2基因,豬DQA基因也具有豐富多態(tài)性。對MHC的基因數(shù)量和分型研究還不很完全,其基因座上的新等位數(shù)目不斷增加。人類、小鼠的研究結(jié)果表明,哺乳動物MHC具有高多態(tài)和多堿基突變的特點(diǎn),國內(nèi)外有關(guān)綿羊和山羊MHC基因的研究證明了這一特點(diǎn)。DQA1基因序列變異可能影響宿主對病原體的免疫應(yīng)答,也可能導(dǎo)致物種間抗病性和疾病易感性發(fā)生變異,從而有可能作為疾病抗性和易感性研究的候選標(biāo)記基因[11]。

3.2 4個(gè)綿羊品種的遺傳多樣性

我國及世界其他地區(qū)綿羊資源品種豐富,如本試驗(yàn)所用洼地綿羊、小尾寒羊、杜泊羊、特克賽爾等,都是肉毛兼用優(yōu)良綿羊品種。本研究使用PCRRFLP技術(shù),對4個(gè)綿羊品種224只群體DQA1基因第2外顯子的分子遺傳多態(tài)性進(jìn)行了初步檢測分析,AluI-RELP出現(xiàn)了兩種等位基因 3種基因型MM 、MN、NN,統(tǒng)計(jì)分析表明MM 基因型只分布于洼地綿羊中,小尾寒羊、杜泊羊及特克賽爾羊沒有該基因型存在;除小尾寒羊外,洼地綿羊、杜泊羊及特克賽爾羊AluⅠ-RELP位點(diǎn)雜合度均高于純合度,MN基因型頻率分別為0.53(53)、0.70(35)、0.83(20);NN基因型頻率分別是為 0.37(37)、0.30(15)、0.17(4);且經(jīng)x2適合性檢驗(yàn)表明4個(gè)綿羊品種224只群體中只有洼地綿羊MHC-DQA1基因exonⅡ在AluⅠ酶切位點(diǎn)達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05),由于部分綿羊品種樣本數(shù)量有限,故此分析有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行印證。4個(gè)綿羊品種AluI-RELP位點(diǎn)上呈低度多態(tài),說明該位點(diǎn)在長期的選擇過程中所受的選擇壓力較小。MHC基因是否和綿羊?qū)膊〉囊赘行院涂共×ο嚓P(guān),還需要收集詳細(xì)的疾病記錄并與基因的基因型進(jìn)行相關(guān)分析,開展對洼地綿羊、小尾寒羊、杜泊羊及特克賽爾羊MHC-DQA1的研究,為這些分析提供了初步的理論基礎(chǔ),有助于揭示不同綿羊品種的抗病機(jī)理,在綿羊抗病育種等領(lǐng)域具有重要的參考價(jià)值。

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Polymorphisms of MHC-DQA1 Gene exonⅡin Four Sheep Breeds

LI Min1,REN Yan-ling2,3,XIAO Na1,DONG Wen-yan1,SHEN Zhi-qiang1,2,3

(1.Shandong Lvdu Biotechnology Ltd.Binzhou,Shandong,256600,China;2.Shandong Binzhou Anmimal Science&Veterinary Medicine Institute,Binzhou,Shandong,256600,China;3.Research and Development Center of Wadi Sheep Breeding Technology,Binzhou,Shandong,256600,China)

The polymorphisms of MHC-DQA 1 gene exonⅡin four sheep breeds(Wadi sheep,Dorper sheeps,small tailed han sheeps and exel sheep)were analyzed.PCR-RFLP method was used to study the genetic polymorphisms of 315 bp MHC-DQA 1 gene exonⅡin 224 samples of four sheep breeds,then the genotypic frequences and allelic frenquency were analyzed.Software Popgen32 was employed to calculate the relative genetic parameters.The results ofAluI-RELP showed that there are two allele M and N atAluⅠ-RFLP locus in 224 samples of four sheep breeds,and by comparing with the allelic frequency,the predominant allele is N;The results of genetic parameters showed that except for small tailed han sheep,the heterozygosity are higher than homogeneity atAluⅠ-RFLP locus in other three sheep breeds;and the results of genetic parameters showed that there were low polymorphism in exon 2 of MHC-DQA1 gene in Dorper sheep,small tailed han sheep and Texel sheep,while it was moderate polymorphism in Wadi sheep.There were low genetic diversities in exonⅡ of MHC-DQA1 gene atAluⅠ-RFLP locus in 224 samples of four Sheep breeds.

Wadi sheep;Dorper sheep;small tailed han sheep;Texel sheep;MHC-DQA1;PCR-RFLP;genetic polymorphism

Q789

A

1007-5038(2011)07-0029-04

2010-12-31

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2008AA10Z142);山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2007D12);山東省良種工程項(xiàng)目(2006GG2209028)

李 敏(1982-),女,內(nèi)蒙古興安盟人,碩士研究生,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。*通訊作者