蟲草頭孢菌粉水提物抗實(shí)驗(yàn)性心律失常作用的研究

姚紅伊，沈 禮，林國華，沈岳良，王如偉，謝強(qiáng)敏，顏小鋒

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥劑科，浙江杭州 310009;2.杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，浙江 杭州 310018;3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江杭州 310058;4.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江杭州 310052)

冬蟲夏草(Cordyceps Sinemis)是我國的傳統(tǒng)的中藥材，傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為其具有補(bǔ)肺益腎等功效［1－2］。近年的研究表明，冬蟲夏草還具有抗心律失常及保護(hù)缺血心肌等作用［3－5］。但由于其特殊的生長環(huán)境和習(xí)性，使得冬蟲夏草數(shù)量稀少，資源稀缺。以往的研究者們雖然采用對(duì)從冬蟲夏草中分離出來的真菌菌株進(jìn)行大規(guī)模深層發(fā)酵培養(yǎng)的方法獲得了相對(duì)高產(chǎn)的蟲草菌粉，但由于蟲草菌粉中含有蟲草多糖、蟲草素、生物堿、核苷類等多種成分，因此存在物質(zhì)組成復(fù)雜，藥效物質(zhì)不明確等缺點(diǎn)。且受到制備技術(shù)的限制，常規(guī)得到的蟲草菌粉存在著抗心律失常的作用弱、缺乏特異性，以及有效成分不明確等問題。故本實(shí)驗(yàn)采用改良技術(shù)(專利號(hào) ZL 200610052509.6)獲取蟲草頭孢菌粉(Cordyceps Cephalosporium Mycelia，CCM)的有效部位，在氯仿、烏頭堿和缺血/再灌誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性心律失常模型上，進(jìn)一步研究該改良技術(shù)提取的蟲草頭孢菌粉是否具有有效對(duì)抗實(shí)驗(yàn)性心律失常的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物KM種小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量20～22 g?！酳D大鼠，體質(zhì)量205～235 g。以上均由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(浙)2005-0020，使用許可證SYXK(浙)2005-0070〕提供。1.2試劑和儀器蟲草頭孢(C.sisensis Chen.sp.nov)由浙江康恩貝制藥股份有限公司制備。蟲草頭孢菌粉活性有效部位由浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司采用中國專利號(hào)ZL 200610052509.6的方法提取，主要含有尿苷35%、腺苷38.1%和胸苷13.0%。臨用前先將CCM溶解于生理鹽水配成100 g·L－1母液，然后依次用生理鹽水配成各濃度的工作液。

烏頭堿(中國藥品生物制品檢定所，110720-200410)配制:先用0.1 mol·L－1HCl溶解，加生理鹽水稀釋，加1 mol·L－1NaOH調(diào)pH至6，加生理鹽水足量至10 mg·L－1，冰箱保存3 d有效。氯仿由浙江迪耳藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。戊巴比妥鈉和胺碘酮由美國Sigma公司生產(chǎn)。烏拉坦由上海天蓮精細(xì)化工有限公司提供。利多卡因(lidocaine)由石家莊新華制藥廠生產(chǎn)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6240C)成都儀器廠生產(chǎn)。

1.3氯仿誘發(fā)的小鼠心律失常模型取100只KM小鼠，♀♂各半，將小鼠隨機(jī)分成5組(n=20)，分別給予以下處理:①空白對(duì)照組:給予生理鹽水。② 陽性對(duì)照組:給予40 mg·kg－1胺碘酮(amiodarone)。③ 低、中、高濃度CCM提取物組:分別給予50、100、200 mg·kg－1CCM 提取物。以上各組均尾靜脈給藥，給藥體積為0.005 ml·g－1體重。給藥15 min后，將小鼠放入500 ml玻璃罩內(nèi)，罩內(nèi)預(yù)先放入浸有4 ml氯仿的棉球，至呼吸停止5 s后，立即取出，采用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖曲線，觀察小鼠室顫(ventricular fibrillation，VF)發(fā)生率，記錄各組產(chǎn)生室顫的動(dòng)物數(shù)。

1.4烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常模型取40只♂SD大鼠，隨機(jī)分為5組(n=8)，分別給予以下處理:①空白對(duì)照組:給予生理鹽水。② 陽性對(duì)照組:給予20 mg·kg－1利多卡因。③ 低、中、高濃度CCM 提取物組:分別給予 50、100、200 mg·kg－1CCM提取物。以上各組均尾靜脈給藥，給藥體積為2 ml·kg－1體重。大鼠用烏拉坦 1.25 g·kg－1腹腔麻醉后仰臥固定，經(jīng)尾靜脈給予不同藥物10 min后，將烏頭堿以經(jīng)頸外靜脈恒速(2 μg·min－1)灌注，采用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖曲線。觀察室性早搏(ventricular premature beats，VPB)、室性心動(dòng)過速(ventricular tachycardia，VT)和室顫(VF)出現(xiàn)的時(shí)間，并計(jì)算相應(yīng)的體重累積烏頭堿用量。

1.5缺血/再灌誘發(fā)的大鼠心律失常模型取32只♂SD大鼠，隨機(jī)分為4組(n=8)，分別給予以下處理:① 空白對(duì)照組:給予生理鹽水。② 低、中、高濃度CCM 提取物組:分別給予50、100、200 mg·kg－1CCM提取物。以上各組均頸外靜脈給藥，給藥體積為2 ml·kg－1體重。大鼠戊巴比妥鈉麻醉后仰位固定，開胸暴露心臟，以肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處的左冠狀靜脈為標(biāo)志，用6/0外科縫線于左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，穿過左冠狀動(dòng)脈前降支及淺層心肌，以備結(jié)扎，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以結(jié)扎10 min作為缺血，心電圖ST段持續(xù)抬高作為結(jié)扎成功的標(biāo)志;松開結(jié)扣10 min作為復(fù)灌。各組藥物均在結(jié)扎前5 min頸外靜脈注射。記錄缺血/再灌注期間室早發(fā)生頻率，室速和室顫的發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間。采用Mest方法評(píng)定心律失常分?jǐn)?shù):0分:竇性心律;20分:Ⅰ°房室傳導(dǎo)阻滯，室上性心律失常;40分:室性早搏二聯(lián)律、三聯(lián)律，Ⅱ°房室傳導(dǎo)阻滯;60分:多源性室早，陣發(fā)室速;80分:室顫;100分:死亡。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在氯仿誘發(fā)的室顫發(fā)生率實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以百分比表示，并采用χ2檢驗(yàn)判斷各組的差異。其他數(shù)據(jù)以±s表示，采用one-way ANOVA以及Newman-Keuls post hoc test做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1CCM提取物對(duì)抗氯仿誘導(dǎo)的小鼠心律失常的作用與對(duì)照組比較，CCM提取物低、中、高3個(gè)濃度組均能降低小鼠室顫發(fā)生率，且CCM提取物對(duì)小鼠室顫發(fā)生率的抑制具有一定的劑量依賴性(Tab 1)，表明CCM提取物對(duì)氯仿誘發(fā)的心律失常有較好的拮抗作用。

Tab 1 Effect of CCM on chloroform induced arrhythmia in mice(±s，n=20)

Tab 1 Effect of CCM on chloroform induced arrhythmia in mice(±s，n=20)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·kg－1 Number of VF occurrence/total VF rate/%Control 19/20 95.0 CCM 50 13/20 65.0*CCM 100 10/20 50.0＊＊CCM 200 7/20 35.0＊＊Amiodarone 40 6/20 30.0＊＊

2.2CCM提取物對(duì)抗烏頭堿誘導(dǎo)的大鼠心律失常的作用與對(duì)照組比較，各濃度CCM提取物組可明顯延長各類心律失常出現(xiàn)的潛伏時(shí)間，相應(yīng)的體重累積烏頭堿用量也增加(Tab 2)，表明CCM提取物對(duì)烏頭堿誘發(fā)的心律失常有較好的拮抗作用。

2.3CCM提取物對(duì)抗缺血/再灌誘導(dǎo)的大鼠心律失常的作用與對(duì)照組相比，各濃度CCM提取物組可明顯減少VPB發(fā)生次數(shù)、VT與VF的發(fā)生率和持續(xù)時(shí)間;且室性心律失常評(píng)分也明顯降低(Tab 3)，表明CCM提取物對(duì)缺血/再灌誘發(fā)的心律失常有較好的拮抗作用。

3 討論

Tab 2 Effect of CCM on aconitine induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of CCM on aconitine induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·kg－1 Accumulated aconitine dose/μg·kg－1 VPB VT VF Control 55.71 ±12.40 69.05 ±11.82 81.55 ±13.08 CCM 50 74.39 ±17.30* 98.55 ±20.44* 124.90 ±24.72*CCM 100 83.31 ±9.18＊＊ 113.10 ±11.21＊＊ 148.40 ±8.39＊＊CCM 200 91.86 ±9.30＊＊ 122.80 ±14.43＊＊ 154.80 ±9.69＊＊Lidocaine 20 99.36 ±10.52＊＊ 124.40 ±10.28＊＊ 152.00 ±11.01＊＊

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。研究表明［3－7］，冬蟲夏草對(duì)心血管系統(tǒng)有廣泛的作用，如降血壓、抗心律失常、抗心肌缺血缺氧、升高血小板和降血脂等。但由于受到以往提取工藝的限制，與西藥相比，冬蟲夏草對(duì)心血管的作用存在起效慢、效價(jià)低、服藥量大、有效物質(zhì)不明確、機(jī)制研究無法深入等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中所用的冬蟲夏草提取物是采用現(xiàn)代提取分離純化技術(shù)(專利號(hào)ZL 20061005250 9.6)和化合物結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究方法獲得的，其物質(zhì)組成明確，有利于進(jìn)一步的藥物作用研究。

Tab 3 Effect of CCM on ischemia-reperfusion induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

Tab 3 Effect of CCM on ischemia-reperfusion induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1 VT VF VPB(beat)Mortality/%Control 99.2 ±34.6 100 89.6 ±22.5 80 79.9 ±61.6 incidence/% duration/s incidence/% duration/s Arrhythmia score 80.0 ±13.3 20 CCM 50 72.8 ±21.7＊＊ 80 46.7 ±27.7＊＊ 50 10.9 ±20.4＊＊ 64.0 ±18.4* 0 CCM 100 21.8 ±14.9＊＊ 30 10.5 ±17.2＊＊ 20 2.3 ±5.0＊＊ 46.0 ±23.2＊＊ 0 CCM 200 10.9 ±7.2＊＊ 20 3.5 ±8.0＊＊ 10 0.6 ±1.9＊＊ 38.0 ±23.9＊＊0

心律失常是臨床心血管系統(tǒng)疾病最常見的癥狀之一，由于心律失常發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前沒有一種單一的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中采用了氯仿、烏頭堿和缺血3種致心律失常的動(dòng)物模型，觀察CCM提取物對(duì)抗心律失常的作用。

本研究表明，CCM提取物具有預(yù)防氯仿誘導(dǎo)的心律失常作用。目前認(rèn)為，氯仿誘發(fā)的室顫可能與氯仿刺激植物性神經(jīng)釋放神經(jīng)遞質(zhì)或腎上腺髓質(zhì)釋放大量兒茶酚胺、繼而激動(dòng)腎上腺素 β受體有關(guān)［8－9］。β受體激動(dòng)后可通過促進(jìn)受體依賴性的胞內(nèi)Ca2+大量釋放，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+貯存庫耗竭，后者觸發(fā)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，最終使胞內(nèi)鈣超載而誘發(fā)心律失常。因此推測，CCM提取物可能通過抑制受體依賴性的細(xì)胞膜上的Ca2+通道而發(fā)揮抗心律失常作用。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，改良技術(shù)獲得的CCM提取物能對(duì)抗烏頭堿引發(fā)的心律失常。烏頭堿引發(fā)心律失常主要是由于它能激活心肌細(xì)胞的快Na+通道，使Na+內(nèi)流加速，從而促使細(xì)胞膜去極化;同時(shí)烏頭堿還能提高心房傳導(dǎo)組織和房室束－蒲肯野系統(tǒng)等快反應(yīng)細(xì)胞的自律性，并誘發(fā)多源性異位節(jié)律點(diǎn)，縮短心肌不應(yīng)期，最終導(dǎo)致心律失常［10－11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CCM提取物可能通過抑制心肌細(xì)胞的快Na+通道而發(fā)揮抗心律失常的作用。

此外研究還發(fā)現(xiàn)，CCM提取物可降低缺血/再灌性心律失常的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)采用冠脈結(jié)扎制備缺血/再灌模型，由此誘發(fā)的心律失常其機(jī)制非常復(fù)雜，可能涉及到多個(gè)環(huán)節(jié)，如氧自由基聚集，酸中毒，交感神經(jīng)興奮引起胞內(nèi)鈣超載等，最終心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯破壞、心功能受損，導(dǎo)致心律失常發(fā)生［12－13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CCM 提取物可對(duì)抗缺血/再灌性心律失常，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

對(duì)于心律失常藥物治療，臨床上雖然有較多，但療效均不理想，因此新型抗心律失常藥的研發(fā)具有重要意義。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測，改良技術(shù)獲得的CCM提取物有較好對(duì)抗氯仿、烏頭堿和缺血/再灌誘導(dǎo)的心律失常模型的作用，為該藥臨床上用于室性心律失常，尤其對(duì)交感中樞興奮所致心律失常、由快反應(yīng)細(xì)胞的自律性增高所致的心律失常提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)其對(duì)急性心肌缺血有明顯的保護(hù)作用，這為該藥在臨床上治療急性心肌缺血性疾病提供了實(shí)驗(yàn)參考。本實(shí)驗(yàn)通過HPLC加量法，測量出本實(shí)驗(yàn)所用的CCM提取物中尿苷的含量為35%，而腺苷的含量為38.1%(重量百分比)。腺苷是人體內(nèi)一種非常重要的內(nèi)源性物質(zhì)，能有效對(duì)抗腎上腺素和氯化鋇等所致室性心律失常，減少大鼠心肌缺血/再灌后室顫的發(fā)生率，對(duì)心血管損傷中起著重要的保護(hù)作用［14－15］。這些活性成分是否是CCM發(fā)揮抗心律失常作用的主要成分還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑镃CM提取物的進(jìn)一步開發(fā)成為抗心律失常和防止心肌缺血損傷的純中藥制劑提供了可行性依據(jù)，值得臨床進(jìn)一步觀察。

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