萬古霉素單用及聯(lián)合利福平或磷霉素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌防耐藥突變濃度的研究

梅 清，喻 婷，朱玉林，程 君，2，3，葉 英，2，3，李家斌，2，3

(1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，2安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心，3安徽醫(yī)科大學(xué)細(xì)菌耐藥研究所，安徽合肥 230022)

萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)感染的首選藥物，但隨著萬古霉素的廣泛應(yīng)用，其最小抑菌濃度(MIC)逐年上升，形成“MIC漂移”現(xiàn)象［1］。萬古霉素中介(VISA)、異質(zhì)性萬古霉素中介(hVISA)以及萬古霉素耐藥(VRSA)的金黃色葡萄球菌也在美國(guó)、日本等多個(gè)國(guó)家被陸續(xù)報(bào)道［2］。目前預(yù)防MRSA菌株進(jìn)一步突變，保護(hù)萬古霉素抗感染活性已成為臨床醫(yī)務(wù)工作者的當(dāng)務(wù)之急。

耐藥突變選擇窗(mutant selection window，MSW)理論是近年來提出的一個(gè)遏制抗菌藥物耐藥的新策略［3］?？咕幬餄舛任挥谝吧舾兄闙IC和防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)之間時(shí)，耐藥突變體就會(huì)被選擇性富集擴(kuò)增。當(dāng)藥物濃度高于MPC時(shí)，這種富集則被抑制。但是由于藥物安全性問題，臨床上單獨(dú)應(yīng)用一種抗菌藥物，要獲得血漿或組織中藥物濃度長(zhǎng)時(shí)間位于MPC以上是很困難的。本研究通過測(cè)定萬古霉素單用及分別與利福平、磷霉素聯(lián)合使用對(duì)10株MRSA臨床分離株的防耐藥突變濃度的變化，在體外初步探討兩種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用防止耐藥突變體的產(chǎn)生的影響，以指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1菌株來源與鑒定安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心2009～2010年收集的臨床標(biāo)本。從中選取10株對(duì)萬古霉素、利福平敏感，同時(shí)對(duì)磷霉素的MIC≤16.0 mg·L－1的MRSA臨床分離株。MRSA的鑒定參照文獻(xiàn)［4］的方法，所有菌株均擴(kuò)增出甲氧西林耐藥基因(mecA)和具有金黃色葡萄球菌種特異性的耐熱核酸酶基因(nuc)。

1.2培養(yǎng)基與儀器M-H培養(yǎng)基購自英國(guó)Oxiod公司。恒溫振蕩培養(yǎng)箱(國(guó)勝儀器廠，江蘇);細(xì)菌比濁儀(Oxiod，英國(guó));32R低溫離心機(jī)(Hettich，德國(guó));多點(diǎn)接種儀(AQS Manufacturing公司，英國(guó))。

1.3抗菌藥物及試劑萬古霉素 (VAN，批號(hào):130360-200301純度:100%)和磷霉素 (FOS，批號(hào):130350-200001純度:99%)均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。利福平(RFP，批號(hào):13292-46-1，250 mg/瓶，純度:97%)和6-磷酸葡萄糖(500 mg/瓶，純度:98% ～100%)均購自Sigma公司 。

1.4最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定采用瓊脂平板倍比稀釋法，結(jié)果按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)CLSI2010年標(biāo)準(zhǔn)［5］判讀。磷霉素采用瓊脂稀釋法進(jìn)行MIC，測(cè)定時(shí)按照CLSI要求每個(gè)瓊脂平板加入終濃度為25 mg·L－1的6-磷酸葡萄糖。

1.5防耐藥突變濃度(MPC)的測(cè)定［6］

1.5.1含單藥瓊脂平板的配制采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定抗菌藥物對(duì)10株MRSA分離株的MPC。以各單藥MIC為基準(zhǔn)，倍比稀釋7個(gè)濃度配置瓊脂平板。藥物終濃度分別為各菌株的1×MIC、2×MIC……64×MIC。每個(gè)濃度配制4個(gè)平板。在測(cè)定磷霉素的MPC時(shí)，每個(gè)瓊脂平板均加入終濃度為25 mg·L－1的6-磷酸葡萄糖。

Tab 1 MICs of 3 antimicrobial agents against 10 strains of MRSA(mg·L－1)

1.5.2含兩藥瓊脂平板的配制以VAN的MIC、MPC為基準(zhǔn)，采用倍比稀釋法配制含兩藥的瓊脂平板，具體方法:分別精密量取1 ml不同MIC倍數(shù)濃度的VAN+1 ml濃度為4.0 mg·L－1的RFP 或1 ml濃度為48.0 mg·L－1的FOS(均為常規(guī)用藥后平均血漿藥物濃度［7］)+18 ml M-H瓊脂，在90 mm平皿中混勻，配制成一系列不同濃度的含兩藥瓊脂平板，每個(gè)濃度配制4個(gè)平板。

1.5.3MPC以及耐藥頻率的測(cè)定從新鮮過夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取單個(gè)菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過夜培養(yǎng)，3 000 r·min－1離心后棄上清液，細(xì)菌再懸浮于200 ml的新鮮MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6 h，離心后將菌液濃度調(diào)整為3×1010CFU·ml－1。取 100 μl菌液放在 90 mm 直徑含不同濃度藥物的MH瓊脂平板上，用L形棒涂布均勻，每個(gè)濃度4個(gè)平板，使每個(gè)藥物濃度的細(xì)菌總接種量為1.2×1010CFU。35℃培養(yǎng)72 h，以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MPC。每次試驗(yàn)均對(duì)接種菌液稀釋后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，以確定接種細(xì)菌量在1010以上。對(duì)接近MPC藥物濃度篩選出來菌株接種于不含藥物的瓊脂平板上，傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其為耐藥突變體。耐藥頻率的計(jì)算按照文獻(xiàn)［8］:將不同藥物濃度平板上的菌落數(shù)除以接種的菌落數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1抗菌藥物對(duì)MRSA的MIC值VAN、RFP和FOS對(duì)10株MRSA的MIC值見Tab 1。

2.2抗菌藥物單用及聯(lián)合使用對(duì)MRSA的MPC和SI值VAN單用及分別與RFP和FOS聯(lián)合使用，對(duì)10株MRSA的MPC和選擇指數(shù)(SI=MPC/MIC)見Tab 2。RFP和FOS單用對(duì)10株MRSA的MPC分別為 ＞1 024 mg·L－1和128 ～1 024 mg·L－1。

Tab 2 MPC(mg·L-1)and SI for vancomycin alone and in combination with rifampicin and fosfomycin respectively against 10 strains of MRSA

2.3耐藥頻率VAN單用以及分別RFP及FOS聯(lián)合使用對(duì)10株MRSA的耐藥頻率見Tab 3。

Tab 3 Drug-resistant frequencies of vancomycin alone and in combination with rifampicin and fosfomycin respectively against 10 strains of MRSA

3 討論

MRSA是引起醫(yī)院感染的重要致病菌，具有多重耐藥性，治療困難，病死率高，是目前臨床治療的難題［9］。萬古霉素一直被認(rèn)為是MRSA感染的標(biāo)準(zhǔn)治療，但有報(bào)道稱其對(duì)MRSA引起的下呼吸道院內(nèi)感染治療失敗率高達(dá)40%以上［10］。MSW理論［3］認(rèn)為:抗菌藥物治療失敗和耐藥菌株的產(chǎn)生可能與臨床藥物劑量落在耐藥突變選擇窗內(nèi)有關(guān)，即只殺滅敏感細(xì)菌，而菌群中少數(shù)自發(fā)耐藥突變體則被選擇性富集。當(dāng)藥物濃度高于MPC時(shí)，病原菌必須同時(shí)發(fā)生兩次或更多次耐藥突變才能生長(zhǎng)，這樣耐藥突變體出現(xiàn)的可能性將極小。因此MPC可作為一項(xiàng)指標(biāo)來評(píng)價(jià)抗菌藥物的抗菌活性、反映藥物抑制耐藥突變選擇的能力。胡暉等［11］測(cè)定了122株MRSA臨床分離株對(duì)萬古霉素的MPC，結(jié)果顯示其MPC90值為22.4 mg·L－1。這與本研究中10株MRSA對(duì)萬古霉素的MPC為16～64 mg·L－1的結(jié)果接近。結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)看，萬古霉素常規(guī)劑量使用后血漿峰濃度Cmax為 25～40 mg·L－1，略高于MPC值，但是由于萬古霉素組織穿透性弱，在肺、骨等組織中分布的藥物濃度遠(yuǎn)低于血漿濃度［12］，往往使感染部位的藥物濃度恰好落在MSW之內(nèi)，若要增大給藥劑量，卻可能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，所以在這種情況下萬古霉素單獨(dú)使用限制耐藥突變體富集的能力并不理想。

MSW理論提供了一種限制耐藥突變體產(chǎn)生的方法［3］:選擇不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用從而關(guān)閉或縮小MSW，達(dá)到防止細(xì)菌耐藥產(chǎn)生同時(shí)不增加不良反應(yīng)的目的。李朝霞等［6］報(bào)道在瓊脂平板實(shí)驗(yàn)中，萬古霉素與左氧氟沙星聯(lián)合使用可以使左氧氟沙星單藥對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW縮小2～4倍，使萬古霉素單藥對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW縮小4～8倍。Firso等［13］運(yùn)用體外藥效學(xué)模型，成功地證明了莫西沙星+多西環(huán)素在防止金黃色葡萄球菌發(fā)生耐藥方面具有協(xié)同作用。近幾年耐甲氧西林葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測(cè)顯示萬古霉素、利福平以及磷霉素對(duì)MRSA仍保持較高的敏感率［14］。本研究將萬古霉素與利福平、磷霉素聯(lián)合使用，SI較其單用分別下降2～16倍和4～32倍，再次證實(shí)了不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合使用可以降低MPC，縮小MSW，減少耐藥菌的生成。這是因?yàn)榧?xì)菌通過單步變異產(chǎn)生耐藥菌的概率為10－7，如果聯(lián)合用藥，細(xì)菌必須通過一步變異同時(shí)獲得對(duì)兩種藥物的耐藥，理論上其發(fā)生率僅為10－14，而人體感染部位的細(xì)菌數(shù)量可達(dá)到1010CFU卻遠(yuǎn)低于1014CFU，因此很難發(fā)生自發(fā)耐藥變異。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萬古霉素與磷霉素聯(lián)合縮小MRSA耐藥突變窗的能力強(qiáng)于萬古霉素與利福平的聯(lián)合方案(P＜0.01)。這可能與磷霉素和利福平各自限制耐藥突變體富集的能力有關(guān)。雖然利福平對(duì)10株MRSA的 MIC≤0.016 mg·L－1，MPC 卻高到無法測(cè)出(＞1 024 mg·L－1)，而磷霉素的MPC則為128～1 024 mg·L－1，其MSW較利福平窄的多。因此，各單藥的MSW越窄，聯(lián)合使用后MPC降低的幅度越大。這一特征與聶大平等［15］對(duì)銅綠假單胞菌防耐藥突變濃度的研究得出的結(jié)論一致。

從耐藥頻率看，萬古霉素分別與利福平、磷霉素聯(lián)用，較單用時(shí)耐藥頻率均有明顯下降(P＜0.01)。也就是說，雖然聯(lián)合用藥時(shí)低濃度萬古霉素(如1×MIC、2×MIC)瓊脂平板上仍然有耐藥突變體的產(chǎn)生，但其數(shù)量大幅降低，這從另一角度也反映出聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥更能防止耐藥突變體的富集。

萬古霉素分別與其他抗菌藥物聯(lián)合治療MRSA感染的方案早有報(bào)道，但以往的研究大部分基于傳統(tǒng)的MIC治療策略［16］。本研究依據(jù)遏制抗菌藥物耐藥的新理論，對(duì)萬古霉素分別聯(lián)合利福平和磷霉素在防耐藥突變濃度方面進(jìn)行了初步的探討，結(jié)果表明這兩種聯(lián)合方案能夠有效的防止耐藥突變體的富集，為臨床合理利用現(xiàn)有抗菌藥物治療MRSA感染，防止耐藥菌的產(chǎn)生提供了理論依據(jù)。由于體內(nèi)藥物濃度處于動(dòng)態(tài)變化中，受到的影響因素也較多，因此聯(lián)合用藥時(shí)藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)與耐藥突變體富集的關(guān)系還需要在體內(nèi)試驗(yàn)中得到進(jìn)一步的研究。

［1］Steinkraus G，White R，F(xiàn)riedrich L.Vancomycin MIC creep in non-vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus(VISA)，vancomycin-susceptible clinicalmethicillin-resistantS.aureus(MRSA)blood isolates from 2001 －05［J］.J Antimicrob Chemother，2007，60(4):788 －94.

［2］Appelbaum P C.Reduced glycopeptide susceptibility in methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)［J］.Int J Antimicrob Agents，2007，30(5):398 －408.

［3］Zhao X，Drlica K.Restricting the selection of antibiotic-resistant mutants:a general strategy derived from fluoroquinolone studies［J］.Clin Infect Dis，2001，33(Suppl 3):147 －56.

［4］陽志強(qiáng)，郭兆彪，宋亞軍，等.用雙重聚合酶鏈快速鑒別葡萄球菌及其甲氧西林耐藥性［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2003，13(10):916－8.

［4］Yang Z Q，Guo Z B，Song Y J，et al.Rapid identification of Staphylococcus and its resistance against methicillin using duplex polymerase chain reaction［J］.Chin J Nosocomiol，2003，13(10):916－8.

［5］Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;twentieth informational supplement［S］.CLSI Document，2010，30(1):1 －153.

［6］李朝霞，劉又寧，王 睿，等.左氧氟沙星聯(lián)合萬古霉素縮小金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗的初步研究［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(8):911 －4.

［6］Li Z X，Liu Y N，Wang R，et al.Preliminary study for narrowing mutant selection window of Staphylococcus aureus by combination of levofloxacin and vancomycinin vitro［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2007，12(8):911 －4.

［7］Kucers A，Scrowe S，Grayson M L，et al.The use of antibiotics:a clinical review of antibacterial，antifungal，and antiviral drugs［M］.5th ed.Boston，Mass:Butterworth-Heinemann，1997:676－92.

［8］Zhanel G G，Mayer M，Laing N，et al.Mutant prevention concentrations of levofloxacin，ciprofloxacin alone and in combination with azithromycin，ceftazidime，colistin(polymyxin E)，meropenem，piperacillin-tazobactam，and tobramycin against Pseudomonas aeruginosa［J］.Antimicrob，Agents Chemother，2006，50(6):2228－30.

［9］黃妮妮，劉 潔.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染流行病學(xué)調(diào)查［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15(1):47 －8.

［9］Huang N N，Liu J.MRSA infection:an epidemiology survey［J］.Chin J Nosocomiol，2005，15(1):47 －8.

［10］Moise P A，Schentag J J.Vancomycin treatment failures in Staphylococcus aureus lower respiratory tract infections［J］.Int J Antimicrob Agents，2000，16(Suppl1):S31 －4.

［11］胡 暉，唐 清.萬古霉素和利奈唑胺對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌防耐藥變異濃度的測(cè)定［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，17(2):374－6.

［11］Hui H，Tang Q.Research on mutant prevention concentration of vancomycin and linezolid against methicillin-resistant staphylococcus aureus［J］.Pract Prevent Med，2010，17(2):374 －6.

［12］Rybak M J.The pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of vancomycin［J］.Clin Infect Dis，2006，42(Suppl.1):S35 －9.

［13］Firsov A A，Vost rov S N，Lubenko I Y，et al.Prevention of the selection of resistant Staphylococcus aureus by moxifloxacin plus doxycycline in anin vitrodynamic model:an additive effect of the combination［J］.Int J Antimicrob Agents，2004，23(5):451 －6.

［14］任 南，文細(xì)毛，吳安華.全國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)對(duì)醫(yī)院內(nèi)金黃色葡萄球菌感染及耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)工程雜志，2007，15(5):425 －7.

［14］Ren N，Wen X M，Wu A H.Study on surveillance of drug resistance of Staphylococcus aureus in hospital infection in national monitoring net of hospital infection［J］.Chin Med Engin，2007，15(5):425－7.

［15］聶大平，董 楓，石宏宴.左氧氟沙星、環(huán)丙沙星單用和聯(lián)合其他抗菌藥物對(duì)銅綠假單胞茵防突變濃度的研究［J］.中國(guó)感染控制雜志，2007，6(6):397 －400.

［15］Nie D P，Dong F，Shi H Y.Study on mutant prevention concentrations of levofloxacin，cipronoxacin alone and in combination with the other antimicrobial agents against Pseudomonas aeruginosa［J］.Chin J Infect Control，2007，6(6):397 －400.

［16］李勇紅，白玉蘭，楮云卓.抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MRSA體外抗菌活性研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(3):418－9.

［16］Li Y H，Bai Y L，Chu Y Z.Study on the antibacterial activity of combined antibacterial agents against MRSAin vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(3):418 －9.