熱療對膀胱癌BIU-87細胞凋亡和生存素表達的影響

劉春來，張西玲，劉屹立，王 平

(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，沈陽110032)

熱療在腫瘤綜合治療中的地位受到越來越多的關注，熱誘導凋亡殺傷腫瘤細胞的機制尚未明了［1，2］。2010 年3 ～9 月，本研究在體外培養(yǎng)條件下觀察熱療對膀胱癌BIU-87細胞的作用及對生存素(survivin)表達的影響，對熱療抑制膀胱癌細胞的可行性及效果進行判定，并探討熱療的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌細胞株BIU-87來自北京大學泌尿外科研究所。四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶、小鼠抗人survivin單抗及小鼠抗人同型對照IgG、羊抗小鼠 IgG-FITC、AnnexinⅤ-FITC試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) BIU-87細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液RPMI 1640含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素。細胞為上皮樣貼壁生長，每2～3 d傳代1次。取生長期細胞接種于培養(yǎng)瓶中，24～48 h后待細胞處于指數生長期，取出細胞用于實驗。

1.2.2 MTT 法 細胞濃度為 2.5 ×104/ml，每孔加100 μl接種于3塊96孔板，待6 h細胞貼壁后，置于37、39、41、43 ℃ 作用 2 h后再置于 37 ℃，培養(yǎng)24、48 和72 h后，每孔加 MTT(5 mg/ml，美國 Sigma公司)20 μl孵育 4 h，棄上清，加入 DMSO 150 μl，酶標儀570 nm處測吸光度A值。設3個復孔取均值，試驗重復3次。計算細胞抑制率:細胞抑制率(%)=(1－實驗組A值/對照組A值)×100。

1.2.3 survivin表達檢測 BIU-87細胞5瓶，置于37、39、41、43℃作用2 h后重新置于37℃培養(yǎng)72 h，4%多聚甲醛4℃固定20 min，PBS洗滌，加入含0.25%Triton X2100 的 PBS 室溫破膜 10 min，PBS洗滌，分別加入100 μl小鼠抗人survivin單抗及小鼠抗人同型對照 IgG(1∶100稀釋)，室溫孵育30 min，再加入 100 μl FITC標記的羊抗小鼠 IgG(1∶100稀釋)，4 ℃避光孵育20 min，調整細胞濃度為1×106/ml。流式細胞術檢測以同型對照管設置陽性界值，survivin抗原表達水平以平均熒光強度表示，試驗重復3次。

1.2.4 細胞周期及凋亡檢測 BIU-87細胞5瓶，置于37、39、41、43℃作用2 h后重新置于37℃培養(yǎng)72 h，70%乙醇固定細胞，加入碘化丙啶和AnnexinⅤ-FITC 4℃避光染色30 min，放入流式細胞儀的樣品室，進行檢測，試驗重復3次。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，方差分析檢驗各樣本間的差異，SNK檢驗分析各樣本間的兩兩差異。以P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 BIU-87細胞生長 熱療使細胞生長受到抑制，單純熱療37℃ 24、48、72 h對BIU-87細胞抑制率分別為 4.92%、9.68%、14.53%，39 ℃ 分別為7.64%、16.53%、23.87%，41 ℃ 分別為 13.63%、20.94%、31.85%，43 ℃ 分別為 31.43%、41.76%、50.21%，不同溫度熱療對BIU-87細胞抑制率各組間差異具有統(tǒng)計學意義，其抑制程度呈溫度依賴性(P ＜0.05)。

2.2 survivin 表達 經 37、39、41、43 ℃ 作用后，BIU-87 細胞 survivin 表達分別為 5.60 ±2.24、3.20±1.36、0.70 ±0.21、0.20 ±0.06，呈溫度依賴性減少(P ＜0.05)。

2.3 細胞凋亡及周期 熱療對BIU-87細胞作用后細胞周期及凋亡變化的影響見表1。

表1 熱療對BIU-87細胞作用后細胞周期及凋亡變化(%)

3 討論

近年來熱療因其安全有效且毒副反應低已越來越多的應用于惡性腫瘤綜合治療。熱作用既可以誘導細胞凋亡，又可以對細胞產生直接致死效應。研究表明熱療通常存在一個臨界溫度，在臨界溫度以下熱誘導細胞凋亡，而臨界溫度以上則主要引起細胞壞死［1］。本研究熱療溫度選擇在37～43℃，建立不同作用時間、不同溫度下熱療對膀胱癌BIU-87細胞細胞株作用的生長抑制曲線，發(fā)現熱療對BIU-87細胞生長有明顯的抑制作用，并且抑制作用呈溫度依賴性。結果顯示，對于BIU-87細胞來說，引起凋亡的最佳條件是43℃。應用流式細胞儀檢測，熱療除有效殺傷癌細胞外，還能誘導細胞周期阻滯，使受熱作用后仍存活的細胞群發(fā)生細胞周期時相同步化，細胞周期阻滯與熱誘導細胞凋亡和細胞增殖抑制密切相關。

熱療可以誘導凋亡相關基因的表達發(fā)生改變［2］，survivin是凋亡抑制蛋白家族重要成員之一，是迄今發(fā)現的作用最強的細胞凋亡抑制因子，不僅抑制細胞凋亡，還參與細胞周期的調控和新生血管的生成。研究表明［3］，survivin高表達于膀胱腫瘤中，是導致膀胱癌復發(fā)的可能性因素。survivin過度表達可能會幫助腫瘤細胞克服G2/M期的凋亡檢測點，并且促進變形細胞通過有絲分裂的變異進程［4］。Wang 等［5］應用兩種 survivin siRNA 靶向治療骨肉瘤細胞MG-63，結果發(fā)現其可以顯著促進細胞凋亡，并且增加阿霉素及順鉑的藥物敏感性。本研究結果表明，BIU-87細胞中survivin的表達隨溫度的增高而逐漸降低，據此推測，熱療可能通過降低survivin表達從而誘導BIU-87細胞的凋亡，但熱療通過何種途徑導致腫瘤細胞凋亡還需要深入探討。

綜上所述，熱療對人膀胱癌細胞株BIU-87有抑制其生長、增殖和誘導凋亡的作用，其促進凋亡的作用呈溫度依賴性。由于熱療副作用小，可應用于膀胱灌注治療和輔助治療膀胱癌。

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