肝復(fù)康片對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性研究

周娟妮 趙詩(shī)云

（1江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 南昌330006；2江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

肝復(fù)康片系根據(jù)部頒中藥成方制劑第7冊(cè)收載的肝復(fù)康丸經(jīng)劑型改革（改變提取工藝及劑型）而成的中藥片劑，功能收斂、益氣、解毒、降谷丙轉(zhuǎn)氨酶，用于急性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化和肝功能不良。為了評(píng)價(jià)其安全性，我們進(jìn)行了肝復(fù)康片長(zhǎng)期毒性研究，并觀察了其毒性作用的可逆性，為臨床安全用藥和毒副反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試品 肝復(fù)康片，每片含生藥量2 g，批號(hào)：091001。

1.2 動(dòng)物 健康6～7周齡SD大鼠160只，體重100～120 g，雌雄各半，清潔級(jí)，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：JZDWNO：2008-0049）。飼養(yǎng)環(huán)境為層流柜屏障系統(tǒng)，溫度20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，噪音低于60分貝。每籠5只，雌雄分開飼養(yǎng)，每組8籠。定時(shí)定量添加飼料和飲水，每?jī)商旄鼡Q墊料一次。鼠全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食。

1.3 儀器及試劑 BS-223S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），7170A全自動(dòng)生化分析儀（日本日立），CD1400血球計(jì)數(shù)儀（美國(guó)），RM2235組織切片機(jī)（徠卡），CX-31生物顯微鏡（Olympus）?？偟鞍诇y(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080210）、白蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080209）均由四川邁克爾生物制品有限公司生產(chǎn)，堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080201）、血糖測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080127）、肌酐測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080313）、尿素氮測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080317）均由北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（批號(hào)：20080109）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（批號(hào)：20080115）均由和光純藥工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)，總膽紅素測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080116）、甘油三酯測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080125）、總膽固醇測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080118）、肌酸磷酸激酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20080121）均由上海榮盛生物技術(shù)公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥[1～2]將動(dòng)物按體重隨機(jī)分為四組，40只/組，雌雄各半，設(shè)對(duì)照組及肝復(fù)康片高、中、低劑量組[18.50、6.15、2.05 g（生藥）/（kg·d）]，分別相當(dāng)于臨床擬用劑量的74.0、24.6、8.2倍）。每日上午9:00～10:00給藥，連續(xù)給藥26周。

2.2 觀察指標(biāo)[1～2]觀察大鼠的外觀特征、行為活動(dòng)、飲食和體重等，每周記錄一次，即時(shí)記錄異常癥狀和體征。于給藥后13周、26周及停藥后2周（恢復(fù)期），每組處理10只、20只和10只動(dòng)物，雌雄各半，眶后靜脈取血，進(jìn)行血液學(xué)和血液生化檢查，處死動(dòng)物，剖取臟器組織稱量濕重，計(jì)算臟器指數(shù)，并進(jìn)行病理學(xué)檢查。血液學(xué)指標(biāo)包括：紅細(xì)胞（RBC）計(jì)數(shù)、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞壓積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）及其分類（LYN/N）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、網(wǎng)織紅細(xì)胞(RC)；血液生化學(xué)指標(biāo)包括：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN），苦味酸動(dòng)力學(xué)法測(cè)肌酐（Cr）、血糖（G1u）、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、總膽紅素（TBil）、肌酸磷酸激酶（CK）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、球蛋白（GLB）、凝血酶原時(shí)間(PT)、K+、Na+、Cl-；臟器指數(shù)包括：腦、肝、心、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸（或子宮）、附睪（或卵巢）；病理檢查包括：大腦、小腦、垂體、肝、心、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸（或子宮）、附睪（或卵巢）、胃、大腸、小腸、淋巴結(jié)、膀胱等。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)動(dòng)物的一般行為、外觀體征等的影響 給藥過程中，對(duì)照組及各給藥組動(dòng)物均發(fā)育正常，皮毛光滑，反應(yīng)機(jī)敏，自主活動(dòng)未見異常，飲食及排泄物亦正常，試驗(yàn)期間無(wú)動(dòng)物死亡。

3.2 對(duì)體重、飼料消耗量、飲水消耗量的影響 給藥13周和26周及恢復(fù)期，各組動(dòng)物體重均持續(xù)增長(zhǎng)，各給藥組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，飲水量、飼料消耗量亦無(wú)顯著性差異。

3.3 對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響 給藥13周和26周，動(dòng)物血液學(xué)檢測(cè)未見明顯異常改變，各給藥組與對(duì)照組比較，血液學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 肝復(fù)康片對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 (±S)

表1 肝復(fù)康片對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 (±S)

時(shí)間 組別 nWBC(109/L) N(%) L(%) RBC(1012/L)HGB(g/L)HCT(L/L) MCV(fL) MCH(pg) MCHC(g/L)PLT(109/L) RC(%)對(duì)照組 10 10.1±1.79 25.4±5.76 74.6±5.76 7.46±0.49 159±6.4 0.42±0.02 56.7±1.72 21.3±1.07 376±18.6 827±144.8 3.05±0.78高劑組 10 10.7±1.61 24.3±7.66 75.7±7.66 7.20±0.49 156±14.0 0.42±0.03 57.9±1.85 21.6±0.93 373±15.5 692±173.6 3.33±0.31給藥13周中劑組 10 10.3±2.56 23.1±4.65 76.9±4.65 7.30±0.51 154±10.7 0.42±0.03 57.5±2.73 21.1±0.79 367±20.7 703±279.3 2.92±0.40低劑組 10 10.0±1.47 22.5±6.06 77.5±6.06 7.16±0.49 152±7.9 0.41±0.03 57.5±1.56 21.3±0.94 370±12.7 696±227.7 3.34±0.70對(duì)照組 20 9.9±1.84 23.4±4.09 76.6±4.09 7.24±0.50 156±12.3 0.41±0.03 57.2±1.84 21.5±1.03 377±21.2 697±216.2 3.11±0.56高劑組 20 10.4±2.33 23.1±6.47 76.9±6.47 7.27±0.42 157±9.0 0.42±0.03 57.3±1.96 21.6±0.94 378±15.0 728±148.2 3.29±0.57給藥26周中劑組 20 10.1±1.50 25.0±7.36 75.0±7.36 7.36±0.56 157±10.4 0.42±0.03 57.2±2.35 21.3±0.88 373±23.1 696±239.5 3.04±0.71低劑組 20 10.0±1.59 23.0±5.82 77.0±5.82 7.25±0.42 154±9.1 0.42±0.02 57.5±1.93 21.3±1.16 370±20.8 806±144.5 3.40±0.60對(duì)照組 10 9.7±2.06 26.1±4.74 73.9±4.74 7.35±0.50 155±12.1 0.42±0.03 57.4±2.36 21.1±0.61 369±22.3 799±187.5 3.35±0.59高劑組 10 10.5±1.42 25.4±7.22 74.6±7.22 7.36±0.58 159±11.9 0.41±0.03 56.3±1.81 21.6±1.23 384±19.0 682±217.0 3.13±0.72恢復(fù)期 中劑組 10 10.9±2.31 21.2±4.31 78.8±4.31 7.19±0.56 155±13.4 0.42±0.03 57.7±1.80 21.5±0.97 373±22.7 711±217.7 3.13±0.47低劑組 10 9.3±1.31 21.8±6.99 78.2±6.99 7.23±0.45 153±7.1 0.42±0.02 57.7±1.76 21.3±0.83 369±11.7 746±184.9 3.33±0.7

3.4 對(duì)血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 給藥13周和26周，動(dòng)物血生化學(xué)檢測(cè)未見明顯異常改變，各給藥組與對(duì)照組比較，血液生化學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見表 2、表 3。

表2 肝復(fù)康片對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 (±S)

表2 肝復(fù)康片對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 (±S)

mol/L) ALT(U/L) AST(U/L) ALP(U/L) CREA(mmol/L) BUN(mmol/L)0.61 46.0±9.08 137.1±12.25 193.7±58.70 23.0±2.64 6.68±1.126 0.90 42.0±5.50 142.7±17.05 222.2±64.30 22.3±3.97 6.89±1.054 0.68 44.3±7.99 144.9±20.15 217.8±74.17 22.5±4.57 6.75±0.801 0.38 43.3±6.77 150.1±13.67 218.2±76.30 22.7±2.13 6.61±0.862 0.44 45.9±8.54 143.4±19.99 216.0±63.32 22.8±4.65 6.77±0.934 0.61 41.5±5.44 135.2±18.41 223.1±54.07 21.0±3.69 6.74±1.145中劑組 20 72.1±6.10 43.5±2.74 0.9±0.41 44.2±7.57 147.7±21.87 236.4±63.94 21.9±3.09 6.36±0.683低劑組 20 71.5±4.56 43.6±2.12 1.1±0.51 43.4±6.85 139.2±19.66 216.6±46.94 23.1±4.87 6.45±0.998對(duì)照組 10 70.5±3.64 42.7±1.55 1.1±0.62 46.4±7.29 141.5±19.36 211.9±68.49 23.2±1.62 6.47±0.718高劑組 10 70.9±4.69 43.5±2.32 1.2±0.98 46.1±7.74 142.0±17.11 210.1±66.12 23.2±4.35 6.77±0.761恢復(fù)期 中劑組 10 74.2±6.06 44.5±2.35 0.9±0.46 41.5±7.53 149.5±15.60 203.2±72.17 21.4±3.47 6.73±1.296低劑組 10 70.4±5.92 43.2±2.45 0.7±0.45 41.1±6.16 141.0±14.36 224.4±67.78 22.8±3.62 6.92±0.929

表3 肝復(fù)康片對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 (±S)

表3 肝復(fù)康片對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 (±S)

時(shí)間 組別 n GLU(mmol/L) CK(U/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) K+(mmol/L) Na+(mmol/L) Cl-(mmol/L) PT（s）對(duì)照組 10 7.88±0.932 724±207.3 1.11±0.413 1.91±0.314 6.4±0.52 144.8±3.35 101.0±1.19 16.5±1.73高劑組 10 7.40±0.948 753±251.0 1.12±0.365 2.16±0.223 6.2±0.42 143.4±2.31 100.4±1.89 16.7±1.91給藥13周 中劑組 10 7.69±0.612 723±237.8 1.01±0.522 1.99±0.355 6.4±0.64 143.0±1.98 100.9±2.02 16.4±1.56低劑組 10 7.76±0.905 658±230.5 1.07±0.411 1.93±0.311 6.3±0.67 143.7±3.47 100.4±1.56 17.1±1.64對(duì)照組 20 7.74±0.833 732±259.8 1.07±0.515 1.88±0.272 6.4±0.53 143.9±3.35 101.4±1.99 16.6±1.81高劑組 20 7.87±0.850 764±187.6 1.12±0.443 1.89±0.391 6.3±0.43 143.9±3.31 101.1±2.16 16.2±1.89給藥26周 中劑組 20 8.16±1.058 743±249.8 1.08±0.345 1.94±0.340 6.3±0.47 144.7±3.43 100.4±2.41 16.5±1.75低劑組 20 8.02±0.928 742±192.1 1.03±0.471 1.87±0.348 6.4±0.59 144.5±2.44 101.6±1.65 16.9±1.55對(duì)照組 10 6.24±0.711 704±157.9 1.10±0.425 1.92±0.359 6.5±0.69 144.4±3.52 100.9±1.78 16.6±1.86高劑組 10 6.34±0.643 712±199.3 1.02±0.509 2.11±0.284 6.3±0.44 143.2±3.97 100.7±1.99 16.4±1.45恢復(fù)期 中劑組 10 6.05±0.885 679±303.6 0.99±0.359 2.05±0.341 6.3±0.47 144.7±3.23 100.2±2.62 16.5±1.34低劑組 10 6.19±1.167 771±248.9 1.22±0.392 1.90±0.247 6.3±0.60 142.2±1.98 100.3±1.86 15.9±1.95

3.5 系統(tǒng)尸檢及病理檢查 系統(tǒng)尸檢，各組組織及器官均未見異常；各給藥組與對(duì)照組比較，臟器指數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見表4。光鏡病理檢查結(jié)果顯示，對(duì)照組及各給藥組均有少數(shù)動(dòng)物肺組織切片出現(xiàn)異常。肺切片可見局部肺氣腫，或肺泡隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。由于各組均散在出現(xiàn)相似肺組織炎性反應(yīng)，出現(xiàn)的數(shù)量也相近，故沒有毒理學(xué)意義。組織病理學(xué)檢查，給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，與對(duì)照組相比，各給藥組均未出現(xiàn)相關(guān)毒性病理改變。系統(tǒng)尸檢及病理檢查顯示，肉眼觀察臟器未見明顯異常，臟器系數(shù)均在正常范圍內(nèi)，高劑量組動(dòng)物臟器組織學(xué)與對(duì)照組一致，基本正常，均未見有特異性組織病變及延遲性病變發(fā)生。

4 討論

大鼠連續(xù)灌胃給藥肝復(fù)康片26周，各給藥組大鼠的皮毛、活動(dòng)、體重、飲食、排泄物及病理學(xué)檢查均未出現(xiàn)異常改變；且大鼠的血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器指數(shù)指標(biāo)與對(duì)照組比較均未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）；光鏡病理檢查結(jié)果顯示，對(duì)照組及各給藥組均有少數(shù)動(dòng)物肺組織切片出現(xiàn)異常，推測(cè)可能與動(dòng)物本身個(gè)體差異以及處理動(dòng)物時(shí)的操作和給藥過程有關(guān)，與藥物無(wú)明顯相關(guān)性，其余動(dòng)物臟器組織學(xué)檢查未見明顯異常。在恢復(fù)2周后，各組各項(xiàng)指標(biāo)正常，未見蓄積毒性產(chǎn)生，未見與藥物有關(guān)的不可逆毒性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，大鼠口服肝復(fù)康片26周未見明顯毒性反應(yīng)的劑量為18.50 g（生藥）/(kg·d)，該劑量相當(dāng)于臨床擬用劑量的74倍。

表4 肝復(fù)康片對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響 (±S) g/kg

表4 肝復(fù)康片對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響 (±S) g/kg

6.92±0.99 4.72±0.87 7.17±0.34 5.03±0.40 7.26±0.50 4.71±0.49 7.49±0.42 5.18±0.15肝31.12±5.38 29.63±2.87 30.63±2.42 31.22±1.59 31.87±1.62 28.92±3.19 32.70±4.10 28.24±2.70心3.41±0.20 3.40±0.34 3.40±0.24 3.51±0.35 3.56±0.47 3.37±0.25 3.73±0.23 3.22±0.19胸腺 1.88±0.59 0.90±0.20 1.68±0.31 1.17±0.19 1.67±0.27 1.22±0.35 1.68±0.32 1.20±0.37肺6.01±0.66 5.28±0.63 5.42±0.69 5.54±0.24 5.34±0.77 4.66±0.87 5.74±0.52 5.39±1.17給藥13周 腎 3.18±0.38 3.14±0.34 3.09±0.40 3.22±0.19 3.28±0.38 3.24±0.24 3.28±0.39 3.27±0.17對(duì)照組 高劑組 中劑組 低劑組時(shí)間 組別 ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂腦2.66±0.17 2.04±0.37 2.74±0.52 2.05±0.34 2.54±0.39 1.78±0.22 2.79±0.62 2.00±0.24睪丸/子宮 2.32±0.67 3.95±0.28 2.00±0.56 3.66±0.10 2.02±0.28 3.51±0.20 1.91±0.39 3.71±0.64附睪/卵巢 0.46±0.07 1.40±0.16 0.43±0.08 1.54±0.30 0.49±0.11 1.31±0.12 0.59±0.19 1.45±0.50腎上腺 0.13±0.02 0.06±0.01 0.14±0.03 0.06±0.01 0.14±0.03 0.06±0.01 0.16±0.03 0.07±0.01腦7.39±0.35 4.96±0.77 7.06±0.55 4.92±0.40 7.19±0.72 5.04±0.60 7.11±0.77 4.99±0.37肝32.47±3.40 28.20±2.84 31.09±3.38 30.51±2.13 30.02±3.21 28.98±2.69 32.09±3.93 29.78±2.63心3.86±0.68 3.33±0.27 3.78±0.40 3.45±0.25 3.63±0.41 3.36±0.33 3.44±0.23 3.32±0.14胸腺 1.77±0.39 0.98±0.21 1.83±0.34 0.95±0.23 1.59±0.37 1.10±0.31 1.57±0.32 1.12±0.32肺5.95±0.65 5.44±0.68 5.61±0.57 5.47±0.63 5.54±0.67 5.29±0.99 5.66±0.68 5.25±0.69給藥26周 腎 3.25±0.35 3.34±0.31 3.23±0.50 3.33±0.27 3.15±0.33 3.29±0.21 3.17±0.29 3.25±0.21脾2.70±0.77 2.14±0.68 2.58±0.35 1.93±0.35 2.67±0.78 1.96±0.22 2.80±0.67 2.14±0.66睪丸/子宮 2.01±0.31 3.86±0.34 2.00±0.67 3.62±0.43 1.71±0.63 3.72±0.49 1.86±0.50 3.57±0.21附睪/卵巢 0.50±0.07 1.45±0.22 0.49±0.18 1.43±0.11 0.49±0.18 1.43±0.20 0.45±0.09 1.47±0.27腎上腺 0.16±0.03 0.07±0.02 0.14±0.02 0.05±0.01 0.14±0.02 0.06±0.01 0.14±0.04 0.06±0.01腦6.80±0.70 5.16±0.47 7.10±0.30 4.99±0.32 7.18±0.51 4.93±0.35 7.34±0.51 4.67±0.96肝32.02±3.20 26.50±1.95 31.37±1.91 28.92±2.14 32.42±2.10 28.22±2.90 33.31±2.55 29.92±3.27心3.58±0.24 3.22±0.18 3.97±0.56 3.34±0.16 4.10±0.63 3.34±0.17 3.64±0.22 3.47±0.48胸腺 1.59±0.39 1.14±0.40 1.73±0.44 0.97±0.20 1.80±0.47 1.09±0.25 1.47±0.13 1.24±0.30肺5.63±0.32 5.40±1.37 5.66±0.45 5.78±0.73 5.77±0.70 4.92±0.79 5.25±0.80 5.15±0.48恢復(fù)期 腎 3.25±0.23 3.19±0.44 3.19±0.31 3.21±0.17 3.52±0.35 3.42±0.27 3.49±0.31 3.26±0.18脾3.02±0.98 2.03±0.37 2.39±0.51 2.33±0.90 2.63±0.33 1.86±0.28 2.77±1.06 1.95±0.17睪丸/子宮 1.81±0.28 3.69±0.63 1.73±0.37 3.68±0.23 1.90±0.52 3.36±0.57 1.84±0.37 3.86±0.26附睪/卵巢 0.55±0.22 1.26±0.18 0.42±0.06 1.32±0.07 0.51±0.03 1.35±0.11 0.47±0.12 1.40±0.26腎上腺 0.14±0.02 0.07±0.01 0.16±0.04 0.06±0.01 0.14±0.02 0.06±0.02 0.14±0.05 0.06±0.01脾

[1]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993.119

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南·毒理學(xué)[M].1994.20