Pirh2蛋白在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

王建亭， 林 楠 (首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，首都醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉科學(xué)院，首都醫(yī)科大學(xué)耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點實驗室， 北京 100020)

泛素－蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是近年來發(fā)現(xiàn)的細胞中重要的非溶酶體蛋白降解途徑，在各種不同的癌蛋白或者轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的降解方面發(fā)揮重要作用。泛素連接酶Pirh2是泛素連接酶E3家族中的一個新成員，其參與了泛素－蛋白酶體途徑，可通過調(diào)控抑癌基因p53的表達，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展。目前，Pirh2在喉癌組織中表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系尚未見報道，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測Pirh2蛋白在喉癌組織中的表達水平，探討Pirh2蛋白表達與喉鱗狀細胞癌(LSCC)臨床分期、組織學(xué)分級和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間的關(guān)系，探討Pirh2在喉鱗狀細胞癌發(fā)生和發(fā)展中所起的作用，為喉癌的診治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 隨機收集2004－2009年我院有完整臨床資料的原發(fā)性喉鱗狀細胞癌手術(shù)切除標本存檔蠟塊57例(喉癌組)，其中16例同時保留有癌旁相臨的安全緣以外的正常喉黏膜組織(對照組)。57例患者中，男47例，女10例;年齡33－72歲，平均(46.56 ±1.89)歲;聲門上型19 例，聲門型35例，聲門下型3例;按UICC2002年TNM分期方案進行分期，其中Ⅰ期30例，Ⅱ期16例，Ⅲ期7例，Ⅳ期4例;組織學(xué)分級，其中 G133例，G217例，G37例;經(jīng)病理證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。所有病例術(shù)前均未行放、化療。病理診斷均為LSCC。全部患者均有完整的隨訪資料。

1.2 試劑 鼠抗人單克隆Pirh2抗體(sc-166293)購自美國Santa Cruz公司，鼠SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒(SP-9002)購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測Pirh2蛋白表達 取存檔蠟塊，4 μm厚切片脫蠟入水，梯度乙醇水化，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，微波修復(fù)抗原，5% －10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，甩出血清，滴加1∶500一抗，37℃孵育1 h，滴加生物素標記二抗，室溫孵育1 h，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，顯色劑顯色(DAB)，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。以PBS液代替一抗為陰性對照，以已知Pirh2陽性切片為陽性對照。結(jié)果判定:陽性表達主要為胞質(zhì)呈棕黃色著色。所有切片采用雙盲法閱片，每張切片任選5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，共計500個細胞，計算陽性細胞所占比例，并據(jù)此對染色結(jié)果分級，Pirh2陽性率﹤25%為陰性(－)，pirh2陽性率 25% －50%為陽性(+)，pirh2陽性率≥50%為強陽性(++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用χ2檢驗，F(xiàn)isher確切概率法，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測 Pirh2蛋白表達結(jié)果Pirh2蛋白在喉癌組和對照組的陽性表達主要定位于胞質(zhì)，呈棕黃色(見圖1)，Pirh2蛋白在喉癌組及對照組中陽性表達率分別為77.19%(44/57)和18.75%(3/16)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖1 Pirh2蛋白在喉癌組織中表達 (SP，×200)Fig 1 Pirh2 protein expression in larynx cancer tissues(SP，×200)

2.2 Pirh2蛋白表達與喉癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 Pirh2蛋白陽性表達率與喉癌患者年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，與喉癌組織學(xué)分級有關(guān)，見表1。

表1 Pirh2在喉癌組織中表達與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 例(%)Tab 1 Relationship between expression of Pirh2 and clinicopathological features in larynx cancer cases(%)

3 討論

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科較常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增長趨勢，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，原癌基因的激活和抑癌基因的失活已被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要環(huán)節(jié)。泛素－蛋白酶體途徑主要經(jīng)細胞內(nèi)的蛋白酶體降解泛素化的蛋白質(zhì)，由泛素激活酶E1、泛素轉(zhuǎn)移酶E2和泛素連接酶E3共同完成，參與了細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、有絲分裂和分化，是蛋白質(zhì)降解的重要途徑，已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究中的新熱點。泛素－蛋白酶體途徑中只有泛素連接酶E3識別底物具有特異性，所以目前的研究大多集中在E3上。泛素連接酶Pirh2是2003年發(fā)現(xiàn)的一個分子量約為30 kD的蛋白質(zhì)，是泛素連接酶E3家族中的一個新成員，由261個氨基酸組成，其中第145－186位是其環(huán)指結(jié)構(gòu)域所在，即泛素連接酶的活性中心。Pirh2因含一個環(huán)指結(jié)構(gòu)域而具有E3的功能，可以泛素化降解抑癌基因p53，參與腫瘤的形成，已經(jīng)被定義為癌基因［1，2］。

Pirh2在惡性腫瘤的主要生物學(xué)行為與其所特有的分子結(jié)構(gòu)鋅指H2環(huán)狀區(qū)域密切相關(guān)，p53作為腫瘤抑制因子在整個惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到非常重要的作用，Pirh2由p53誘生，Pirh2通過自身相互作用和泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的作用負反饋調(diào)節(jié)p53，控制著p53的水平，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞發(fā)生和發(fā)展。Pirh2與肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等關(guān)系的相關(guān)研究已有報道［3－7］，而 Pirh2與喉癌關(guān)系的相關(guān)研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組Pirh2陽性表達率為77.19%(44/57)，顯著高于對照組Pirh2陽性表達率18.75%(3/16)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。提示Pirh2在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用。本研究中，在喉癌不同組織學(xué)分級中，G1與G2+G3級比較，Pirh2陽性表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示Pirh2過表達與喉癌的惡性程度有關(guān)。本研究還顯示，Pirh2陽性表達與喉癌患者的年齡、性別、臨床分型(腫瘤部位)、臨床 TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，提示Pirh2過表達只是喉癌發(fā)生、發(fā)展過程中一個較早期的重要分子事件。

本研究結(jié)果表明，Pirh2可能與喉癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，Pirh2在喉癌組織中高表達，Pirh2高表達與喉癌的組織學(xué)分級有關(guān)，檢測Pirh2表達可能為判斷喉癌的惡性程度提供理論依據(jù)。Pirh2作為一種癌基因，如能阻斷其高表達，或許對指導(dǎo)喉癌治療有一定價值。

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