CEACAM1和VEGF在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系

許剛柱， 劉凱歌， 張俊鋒， 丁志斌， 張 鵬， 付 強(qiáng)， 盛旭東 (西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 西安 710077;通訊作者，E-mail:kaigeliu@gmail.com)

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率位居顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤首位，呈惡性侵襲性發(fā)展，其中廣泛間質(zhì)微血管形成是膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)基礎(chǔ)，但目前關(guān)于膠質(zhì)瘤血管生成的機(jī)制尚不清楚。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)基因家族成員之一，對(duì)體內(nèi)外血管生成分析顯示，CEACAM1有血管生成活性［1］，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進(jìn)腫瘤血管生成的最主要因子之一，CD105則是一種主要表達(dá)于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的糖蛋白，是目前最好的血管標(biāo)志物［2］。本研究采用免疫組化法檢測(cè)正常腦組織及膠質(zhì)瘤中 CEACAM1、VEGF和 CD105標(biāo)記的MVD表達(dá)情況，探討CEACAM1、VEGF與膠質(zhì)瘤血管生成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2008－04～2010－04西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及西京醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本62例，其中男性35例，女性27例，年齡17－73歲(平均43.5歲)。所有標(biāo)本常規(guī)切片，HE染色后根據(jù)2000年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)分類，其中Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ級(jí)18例，Ⅳ級(jí)13例。另取因顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)患者15例的正常腦組織作為對(duì)照(與家屬溝通后簽字同意用作科學(xué)研究，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意)。

1.2 主要試劑及方法 兔抗人CEACAM1單克隆抗體購自美國Epitomics公司，鼠抗人VEGF單克隆抗體購自美國Labvision公司，鼠抗人CD105單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，免疫組化SP試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司。采用SP法檢測(cè)，按常規(guī)步驟進(jìn)行，兔抗人CEACAM1單克隆抗體滴度為1∶70，鼠抗人 VEGF單克隆抗體滴度為1∶50，鼠抗人 CD105 單克隆抗體滴度為 1∶50，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定與計(jì)數(shù) ①CEACAM1陽性判定方法:細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。采用陽性標(biāo)記指數(shù)(label index，LI)判定染色結(jié)果，即在每張切片陽性細(xì)胞最多的區(qū)域計(jì)數(shù)500－1 000個(gè)細(xì)胞，按LI(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%計(jì)算出每例的LI，每組數(shù)據(jù)用±s表示。

②VEGF陽性判定方法:VEGF陽性染色為棕黃色顆粒樣著色，定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。觀察計(jì)數(shù)方法同CEACAM1。

③CD105陽性判定及MVD計(jì)數(shù):CD105陽性染色為血管內(nèi)皮細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色著色。MVD計(jì)數(shù)參照Weidner等［3］的方法:先在低倍視野(×10倍)下選取腫瘤微血管密度最高區(qū)(熱區(qū))，再于高倍視野(×100倍)下計(jì)數(shù)，凡呈現(xiàn)棕黃(褐)色的單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇，只要其與鄰近腫瘤細(xì)胞或結(jié)締組織成分有明顯區(qū)別，即可記數(shù)為1個(gè)微血管數(shù)。每張切片記錄5個(gè)高倍視野下微血管數(shù)目，取其均值作為該標(biāo)本的MVD(±s)，用MVD值表示CD105表達(dá)數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。全組數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，總體有差異后進(jìn)一步用LSD進(jìn)行兩兩比較。相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤與正常腦組織CEACAM1的表達(dá) 本研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM1在正常腦組織中無表達(dá)(圖1)，在各級(jí)膠質(zhì)瘤組織中均有CEACAM1陽性表達(dá)(圖2)。各級(jí)膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中CEACAM1的表達(dá)相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且膠質(zhì)瘤各級(jí)別之間比較，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見表1)，隨病理分級(jí)升高逐漸增高(r=0.857，P ＜0.01)。

圖1 正常腦組織CEACAM1陰性表達(dá) (SP，×400)Fig 1 CEACAM1 protein negative expression in normal brain tissues(SP，×400)

圖2 Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤CEACAM1陽性表達(dá) (SP，×400)Fig 2 CEACAM1 protein positive expression in gradeⅢglioma(SP，×400)

2.2 膠質(zhì)瘤與正常腦組織VEGF表達(dá) 正常腦組織中未見VEGF表達(dá)。VEGF陽性染色定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞質(zhì)(圖3)。從表1可見，不同病理分級(jí)的腫瘤細(xì)胞VEGF的陽性細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)不同，與正常腦組織相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且隨病理分級(jí)提高逐漸增高(r=0.968，P ＜0.01)。

2.3 CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù) CD105蛋白陽性定位于腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃(褐)色細(xì)顆粒狀。正常腦組織未見CD105陽性表達(dá)，各級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本均有CD105陽性表達(dá)(圖4)。各級(jí)別膠質(zhì)瘤與正常腦組織中CD105-MVD的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且隨病理分級(jí)提高逐漸增高(r=0.780，P ＜0.01)。

表1 CEACAM1、VEGF表達(dá)及MVD與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(±s)Tab 1Relationship of CEACAM1，VEGF expression and MVD with clinicopathological characteristics(±s)

表1 CEACAM1、VEGF表達(dá)及MVD與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(±s)Tab 1Relationship of CEACAM1，VEGF expression and MVD with clinicopathological characteristics(±s)

單因素方差分析，aF=68.235，P ＜0.01;bF=786.332，P ＜0.01;cF=30.418，P ＜0.01;然后采用 LSD 兩兩比較均 P ＜0.01

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圖3 Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤VEGF陽性表達(dá) (SP，×400)Fig 3 VEGF protein positive expression in gradeⅣglioma(SP，×400)

圖4 Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤CD105陽性表達(dá) (SP，×100)Fig 4 CD105 protein positive expression in gradeⅢglioma(SP，×100)

2.4 CEACAM1、VEGF表達(dá)和 CD105-MVD 與膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CEACAM1、VEGF表達(dá)和CD105-MVD與患者的性別、年齡及腫瘤大小無明顯相關(guān)(P ＞0.05，見表1)。

2.5 CEACAM1、VEGF表達(dá)與MVD的相關(guān)性 相關(guān)分析顯示，CEACAM1表達(dá)與MVD呈正相關(guān)(r=0.889，P ＜0.01)，VEGF表達(dá)與 MVD 亦呈正相關(guān)(r=0.803，P ＜0.01)，且 CEACAM1 與 VEGF 表達(dá)亦呈正相關(guān)(r=0.846，P ＜0.01)。

3 討論

CEACAM1作為一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，可以調(diào)節(jié)同源性、異源性黏附，并且在一些正常人體組織中包括結(jié)腸、乳腺、前列腺和子宮都有表達(dá)，除此之外CEACAM1在這些組織的惡性病變中都減少表達(dá)或不表達(dá)，CEACAM1表達(dá)的丟失和惡性腫瘤的分級(jí)相關(guān)，故而CEACAM1被推測(cè)具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)［4］。但在肺癌和胰腺癌的研究中則提出了與CEACAM1具有腫瘤抑制效應(yīng)相反的結(jié)果［5，6］:CEACAM1 陽性病例惡性程度上升，說明CEACAM1的表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

本文研究結(jié)果顯示，CEACAM1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較正常腦組織中明顯升高(P＜0.01)，說明膠質(zhì)瘤組織也存在CEACAM1異常高表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)CEACAM1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)并不只是在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞質(zhì)中亦有表達(dá)。Zhou等［7］通過在胃癌中的研究認(rèn)為，CEACAM1分布的改變(從細(xì)胞膜到細(xì)胞質(zhì))在腫瘤血管發(fā)生中是一個(gè)重要的事件，并且CEACAM1的高表達(dá)促進(jìn)了癌細(xì)胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。在口腔癌中的研究［8］表明，分化良好的鱗狀細(xì)胞癌中CEACAM1呈現(xiàn)為細(xì)胞膜表達(dá)，低分化和中分化分化性腺癌則是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá);細(xì)胞膜的CEACAM1表達(dá)抑制血管發(fā)生和淋巴管發(fā)生，但是胞質(zhì)的CEACAM1表達(dá)則促進(jìn)血管發(fā)生，甚至通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞變形而促進(jìn)淋巴管形成。膠質(zhì)瘤中CEACAM1表達(dá)部位的改變與血管生成的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究。

我們發(fā)現(xiàn)CEACAM1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與患者的年齡、性別以及腫瘤大小無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與腫瘤的病理分級(jí)密切相關(guān)(P ＜0.01)。腫瘤的惡性程度越高，CEACAM1的陽性表達(dá)率越高，故而說明CEACAM1表達(dá)的上調(diào)可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要生物事件，提示CEACAM1在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中可能扮演著癌基因的角色，這與Sienel等［9］的研究結(jié)論類似:提示 CEACAM1表達(dá)升高是一不利的預(yù)后指標(biāo)，它可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)。

VEGF又稱血管滲透性因子(vascular peameability factor，VPF)，是腫瘤形成過程中最重要的刺激因子，在血管發(fā)生和形成過程中都具有重要的作用［10］。它具有雙重功能:一方面通過其受體直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶和組織因子來促進(jìn)血管形成;另一方面，提高血管通透性，促進(jìn)血漿蛋白、纖維蛋白原外滲導(dǎo)致腫瘤間質(zhì)水腫，引起細(xì)胞外基層改變，從而為腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移提供適合的基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中膠質(zhì)瘤中VEGF的表達(dá)明顯高于正常腦組織(P＜0.05)，不同病理分級(jí)的腫瘤細(xì)胞VEGF的陽性細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)不同，高度惡性組明顯高于低度惡性組，經(jīng)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明VEGF與膠質(zhì)瘤的惡性度有關(guān)，提示VEGF蛋白的高表達(dá)在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，可作為反映膠質(zhì)瘤惡性程度的指標(biāo)。

微血管密度(MVD)是檢測(cè)腫瘤血管形成活性的重要指標(biāo)。CD105僅在處于增殖狀態(tài)的腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞(即新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞)上強(qiáng)烈表達(dá)，而在正常組織的血管上無或僅微弱表達(dá)［11］，是一種新的內(nèi)皮細(xì)胞增殖標(biāo)記物。本研究應(yīng)用CD105標(biāo)記膠質(zhì)瘤微血管并對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示:CD105在膠質(zhì)瘤內(nèi)呈特異性高表達(dá)，其標(biāo)記的MVD顯著高于正常腦組織，提示CD105在膠質(zhì)瘤血管形成中起重要作用，可作為膠質(zhì)瘤新生血管生成的理想標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，CEACAM1、VEGF均與CD105標(biāo)記的 MVD呈正相關(guān)，提示 CEACAM1、VEGF可能均有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用;且CEACAM1和VEGF具有明顯的相關(guān)性，提示兩種蛋白可能在新生血管形成中具有協(xié)同作用。

腫瘤中CEACAM1表達(dá)升高的機(jī)制目前尚不清楚，呂滿義等［12］研究認(rèn)為可能與CEACAM1促進(jìn)這些腫瘤組織血管生成有關(guān)，CEACAM1可能是一種促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。Ergun等［1］對(duì)體內(nèi)外血管生成分析顯示，CEACAM1有血管生成活性，利用雞絨膜尿囊膜培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)，不管是從人粒細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分離的CEACAM1還是重組的CEACAM1都有血管形成特性，而且CEACAM1的單克隆抗體可以在體外阻斷VEGF介導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的作用，VEGF使培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞的CEACAM1在mRNA及蛋白水平上都是增加的。一方面CEACAM1表現(xiàn)出與VEGF相似的成血管特性，另一方面功能性抑制CEACAM1可以完全抑制VEGF誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)事件的發(fā)生，表明VEGF的基本成血管特性可能是CEACAM1調(diào)節(jié)的。

總之，CEACAM1、VEGF及CD105-MVD均可作為反映膠質(zhì)瘤惡性程度的指標(biāo);CEACAM1在膠質(zhì)瘤中扮演著癌基因的角色，其表達(dá)增加可能引起膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展;CEACAM1可能作為一種促血管生長(zhǎng)因子而刺激腫瘤血管的生成，隨著對(duì)CEACAM1研究的深入可能會(huì)對(duì)膠質(zhì)瘤的防治產(chǎn)生有益的影響。

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