白花敗醬草對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞周期和PCNA表達(dá)的影響

張 濤,田黎明,王 昭,田麗華

(佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

白花敗醬草是敗醬科草本植物的根莖及帶根全草,具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、改善肝功能、抑菌和抗病毒等作用[1]。民間驗(yàn)方中與其它中藥配伍,用于治療腸癌和膀胱癌[2]。有報(bào)道此藥可抑制鼠源性腹水癌[3]。但有關(guān)白花敗醬草皂苷在抗腫瘤方面的作用,國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討白花敗醬草的抗腫瘤作用與機(jī)制,為尋找有效的抗腫瘤藥物提供部分理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

昆明種雌性小鼠(6周齡20～22g),中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)提供。動(dòng)物隨機(jī)分瘤源鼠組、皂苷低組(50mg/kg?d)、皂苷高組(100mg/kg? d)、CTX(環(huán)磷酰胺25mg/kg?d)組及對(duì)照組。每組10只,瘤源鼠組腹腔注射U14細(xì)胞株0.2mL/只,注射7d后在無菌條件下吸取腹腔中的腹水型瘤細(xì)胞,稀釋成 1.6×106個(gè)/mL,無菌條件下給其余5組小鼠每只左前腋下接種0.2mL瘤細(xì)胞。在接種瘤細(xì)胞24h后,給各組鼠灌服皂苷,對(duì)照組灌服同劑量的涼開水;CTX組按25mg/kg?d腹腔注射 CTX;連續(xù)14d,第15天小鼠摘眼球取血后,斷髓處死,剝離瘤體稱重。

1.2 瘤細(xì)胞株

U14鼠宮頸癌細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 藥物制備及主要試劑

白花敗醬草購于中國河北省秦皇島市民樂醫(yī)藥公司,由安國市昌達(dá)中藥材飲片有限公司提供,此藥通過秦皇島市藥材公司鑒定。白花敗醬草粉碎按1:10用70%食用酒精浸泡4h,加熱回流提取2次濾液,減壓回收乙醇,得白花敗醬草醇粗提物[4],此醇提物上AB8大孔吸附樹脂層析柱后用蒸餾水洗脫至洗脫液中無糖為止(M olish反應(yīng)陰性)。再分別用30%、50%和70%乙醇洗脫,收集各濃度的洗脫液,至各洗脫液Liberman-Burchard反應(yīng)陰性為止?；旌细飨疵撘?減壓濃縮真空干燥得白花敗醬草總皂苷粗提物。AB8大孔吸附樹脂購于天津南開大學(xué)化工廠,環(huán)磷酰胺(CTX):江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品,PCNA免疫組化試劑盒購于福建邁新生物技術(shù)有限公司。

表1 白花敗醬草皂苷對(duì)U14荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用(±s)

表1 白花敗醬草皂苷對(duì)U14荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用(±s)

與對(duì)照組比較**P＜0.01。

組 劑量(mg/kg) 動(dòng)物數(shù) 體____重開始___________結(jié)束 開始 結(jié)束 腫瘤重量(g) 抑制率(%)對(duì)照組 10 9 24.33±1.92 32.67±2.14 2.82±0.92 CTX 組 25 10 10 24.10±1.62 28.27±2.46 1.59±0.45** 43.62皂苷低組 50 10 10 24.73±1.27 30.57±0.83 1.83±0.43** 35.11__皂苷高組 100__________________10_______________10_______________________________________________________________________________24.15±0.99_28.12±1.30_1.21±0.11**_57.09

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

腫瘤組織細(xì)胞PCNA蛋白的檢測(cè):對(duì)照組、皂苷高及CTX組的瘤體切片采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)(按試劑盒說明書操作),光鏡下觀察PCNA蛋白的表達(dá),判斷標(biāo)準(zhǔn):褐色核表達(dá)的是陽性細(xì)胞,藍(lán)色核表達(dá)的是陰性細(xì)胞,隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡(40倍)視野中陽性細(xì)胞百分率。細(xì)胞周期分析和細(xì)胞凋亡檢測(cè):對(duì)照組、皂苷高及CTX組的瘤體組織剪碎,用200目過濾制備單細(xì)胞懸液。離心洗滌3次后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL,4℃70%的乙醇固定30min,用含RNA酶的碘化丙啶染色液染色30min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量和分析細(xì)胞周期,并用Muhicycle軟件處理,得出細(xì)胞各周期的百分率和凋亡細(xì)胞百分率[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SAS 9.13軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間差異的顯著性先進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析,再采用 dunnet‵t檢驗(yàn) 。

2 結(jié)果

2.1 白花敗醬草總皂苷對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤的抑制率

對(duì)照組瘤體平均重量為(2.82±0.92)g,皂苷低、高和CTX組,瘤體重量分別為(1.83±0.43)g、(1.21±0.11)g和(1.59±0.45)g,給藥組瘤體重量明顯低于對(duì)照組(P＜0.01),腫瘤的抑制率分別是 35.11%、57.09%和43.62%(見表 1)。

圖1 白花敗醬草皂苷對(duì)腫瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響(SP×100)

2.2 白花敗醬草皂苷對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響

皂苷高、CTX與對(duì)照組比較,PCNA蛋白的陽性細(xì)胞率明顯減少,分別是(21.8±3.19)%、(26.2±3.68)%和(80.6±6.02)%;可見各給藥組PCNA、蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01,見表2,圖1)。

表2 皂苷對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響

2.3 白花敗醬草皂苷對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞周期和凋亡的影響

皂苷高組和CTX組,處于G0/G1期的腫瘤細(xì)胞數(shù)由對(duì)照組的38.1%增加為68.5%和65.0%,而處于S期和G2/M期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)減少;腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)由對(duì)照組的(9.42±0.16)%增至(28.92±1.24)%和(23.86±0.13)%,結(jié)果見表3,圖2。

表3 白花敗醬草皂苷對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞周期和凋亡的影響

圖2 白花敗醬草皂苷對(duì)U14荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞周期的影響

3 討論

腫瘤發(fā)生的主要特征是細(xì)胞周期失調(diào)后導(dǎo)致的細(xì)胞無限制增殖,阻止癌細(xì)胞分裂即可達(dá)到抑制其惡性生長(zhǎng)甚至將其殺滅的目的,實(shí)際上多數(shù)腫瘤化療藥物均是細(xì)胞周期的抑制劑。腫瘤細(xì)胞增殖的速度主要決定于G0/G1期的長(zhǎng)短及參與分裂的細(xì)胞數(shù)量的多少[5]。本實(shí)驗(yàn)灌服100mg/kg?d皂苷和25mg/kg?d腹腔注射CTX后,U14荷瘤鼠瘤體組織細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)由對(duì)照組的38.1%增加為68.5%和65.0%,而處于S期和G2/M期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)減少,可見敗醬草皂苷和環(huán)磷酰胺可使腫瘤細(xì)胞主要受阻于G0/G1期,G0/G1期阻滯使腫瘤細(xì)胞周期延長(zhǎng),S期細(xì)胞減少使參與分裂的細(xì)胞數(shù)減少,進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞的增殖速度降低,達(dá)到抑制其生長(zhǎng)繁殖的作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是不同機(jī)制的抗癌藥物發(fā)揮作用的共同途徑[6]。本研究表明,U14荷瘤鼠灌服大劑量白花敗醬草皂苷后,腫瘤組織細(xì)胞凋亡率由對(duì)照組的(9.42±0.16)%明顯上升為(28.92±1.24)%,環(huán)磷酰胺組細(xì)胞凋亡率也增致為(23.86±0.13)%,揭示敗醬草皂苷可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,使腫瘤細(xì)胞數(shù)減少。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是敗醬草皂苷抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的又一機(jī)制。

PCNA是細(xì)胞核內(nèi)DNA聚合酶δ的輔助蛋白,許多研究發(fā)現(xiàn)PCNA在G0～G1期細(xì)胞中無明顯表達(dá),G1晚期表達(dá)增加,S期達(dá)到高峰,G2/M期明顯下降,PCNA量的變化與DNA合成一致,可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)[7]。本研究表明,對(duì)照組腫瘤組織細(xì)胞PCNA蛋白高表達(dá),而皂苷和CTX能抑制腫瘤細(xì)胞中PCNA的表達(dá),同時(shí)阻止腫瘤細(xì)胞于G1期,揭示腫瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)量與其增殖分化程度相一致,提示白花敗醬草皂苷可以抑制PCNA的表達(dá),推測(cè)可阻止腫瘤細(xì)胞DNA的合成,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。總之白花敗醬草皂苷能抑制體內(nèi)U14宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng),其抗腫瘤作用可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,干擾腫瘤細(xì)胞周期,抑制腫瘤細(xì)胞中PCNA基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)其抑制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。

[1]陳炳華.白花敗醬草食療價(jià)值高[J].植物雜志,2002,6:15

[2]劉春安,彭明.抗癌中草藥大辭典[M].武漢:湖北科學(xué)出版社,1994,624

[3]Dharmananda S.1997.The treatment of gastro-intestinal cancers with Chinese medicine.http://www.itmonline.org/arts/gicancer.htm.

[4]徐潔昕,周方欽,江放明.白花敗醬總皂甙提取工藝研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005,29(3):227-229

[5]許杜娟,吳強(qiáng),楊雁.黃芪總苷的抑瘤作用及其機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2003,19(7):823-826

[6]M akin G.,Dive C.Apoptosis and cancer chemotherapy[J].Trends in Cell Biology,2001,11:22-26

[7]魏永昆.增殖細(xì)胞核抗原與腫瘤研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè),1996,23(增刊):47-49

[8]栗坤,王淑香,趙海峰.茜草醇提物對(duì)小鼠 U14宮頸癌抑制作用的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2008,31(6):16