豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展＊

劉閏夏，藺 濤，2，韋祖樟，孫利廠，2，陸嘉琦，袁世山＊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的豬的一種高度接觸性傳染病，該病臨床表現(xiàn)形式多樣，主要為母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病首先在美國(guó)、荷蘭等地報(bào)道，之后在世界范圍內(nèi)迅速流行，并且成為當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病。1996年，郭寶清等首次在我國(guó)境內(nèi)分離到該病原，2006年我國(guó)江西、江蘇、安徽等多個(gè)南方省份暴發(fā)了豬“無(wú)名高熱病”，經(jīng)研究證實(shí)，引起該病的主要病原為發(fā)生遺傳變異的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒。本文綜述了PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展。

1 PRRSV基因組和表達(dá)調(diào)控

PRRSV屬于套式病毒目（Nidovirales），動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae），動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus），同屬的還有馬動(dòng)脈炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）、小鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒（Lactate dehydrogenase－elevating virus，LDV）和猴出血熱病毒（Simian hemorrhagic fever virus，SHFV）。根據(jù)血清型和遺傳特性的差異，可將PRRSV劃分為2個(gè)基因型，即歐洲（Ⅰ）型（代表株Lelystad virus，LV ）和美洲（Ⅱ）型（代表株 VR－2332），2個(gè)基因型在核酸水平上同源性約為60%。

PRRSV為不分節(jié)段、聚腺苷酸化、有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組長(zhǎng)度約為15kb，5＇非翻譯區(qū)（untranslated region，5′UTR）長(zhǎng)為189～222核苷酸（nucleotide，nt），3＇UTR長(zhǎng)約114nt～151 nt。目前已知含有10個(gè)首尾重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。5′端的2個(gè)最大的ORF1（ORF1a和 ORF1b）占基因組長(zhǎng)度的 3／4。ORF1通過(guò)程序性－1核糖體移碼（programmed－1 ribosome frame shifting）機(jī)制編碼產(chǎn)生2個(gè)多聚蛋白pp1a和pp1ab，多聚蛋白再經(jīng)過(guò)自身編碼的蛋白酶切割產(chǎn)生14個(gè)推測(cè)的非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為Nsp1a，Nsp1β，Nsp2－6，Nsp7a，Nsp7β及 Nsp8－12，這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和拮抗干擾素等過(guò)程中起到重要的作用［1］。基因組近3′端有8個(gè)開放閱讀框編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)需要通過(guò)非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄（discontinuous transcription）機(jī)制產(chǎn)生亞基因組 mRNA（subgenomic mRNA，sgmRNA）。PRRSV 5′UTR的3′末端最后6個(gè)堿基為病毒種特異性保守序列（5′－UUAACC－3′），稱 為 前 導(dǎo) 序 列 連 接 位 點(diǎn) （Leader Junction Site，LJS）。這一保守序列同時(shí)存在于基因組下游的每個(gè)ORF之前，每個(gè)下游的5′－UUAACC－3′被相應(yīng)地稱為編碼體序列連接位點(diǎn)（body junction site，BJS）。5′UTR 的 LJS與下游的每個(gè)ORF前的BJS相互配對(duì)，從而介導(dǎo)5′UTR與下游序列的非連續(xù)性跳躍連接，稱為“非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄”。除ORF7外，mRNA在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)為多順?lè)醋樱╬olycistronic），即每一個(gè)下游ORF序列都存在于上游ORF的mRNA分子中，但是除mRNA2外它們?cè)诠δ苌蠀s表現(xiàn)出單順?lè)醋拥奶匦裕疵織lmRNA最5′端的基因翻譯產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白，mRNA2因同時(shí)編碼ORF2a和ORF2b，呈現(xiàn)為雙順?lè)醋印Ｗ钚掳l(fā)現(xiàn)的ORF5a大部分序列與ORF5重疊，它們是否由同一個(gè)mRNA編碼還尚未證實(shí)。

2 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

已知PRRSV有8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。GP2a、GP3、GP4和GP5等囊膜糖蛋白分別由ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5編碼，非糖基化囊膜E蛋白、ORF5a蛋白、膜基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N分別由ORF2b、ORF5a、ORF6和 ORF7分別編碼［2］。根據(jù)囊膜蛋白在病毒粒子中組成的量，囊膜蛋白可分為主要囊膜蛋白（major enveloped protein）和次要囊膜蛋白（minor enveloped protein），GP5和 M 蛋白是病毒粒子的主要組成部分，稱為主要囊膜蛋白。而GP2a、GP3、GP4和E蛋白在病毒粒子表面的含量相對(duì)較少，則稱之為次要囊膜蛋白（minor enveloped protein）。

2.1 次要囊膜蛋白

2.1.1 GP2a GP2a由ORF2編碼，分子質(zhì)量為29 ku～30ku，屬于Ⅰ型整合膜糖蛋白，N端和C端的疏水結(jié)構(gòu)域分別作為信號(hào)肽序列和膜錨定序列。GP2有兩個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)，Ⅰ型PRRSV位于N173和N179位點(diǎn)，而Ⅱ型PRRSV位于N178和N184位點(diǎn)。在Ⅰ型PRRSV反向操作的基礎(chǔ)上，將這2個(gè)糖基化位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變克隆均能拯救出病毒，說(shuō)明Ⅰ型PRRSV GP2a的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)（N173和N179）對(duì)感染性病毒粒子的形成都是非必需的［3］。有趣的是，Ⅱ型PRRSV GP2a的N184位糖基化位點(diǎn)對(duì)感染性病毒粒子的產(chǎn)生是必需的，可能該位點(diǎn)在GP2a蛋白的正確折疊或與其它糖基化蛋白的相互作用中起重要作用。但是，值得指出的是，Tian等將Ⅰ型PRRSV的ORF2－ORF4替換到Ⅱ型PRRSV感染性克隆，能夠拯救出嵌合病毒，說(shuō)明PRRSV的小囊膜蛋白的功能在型間能夠互補(bǔ)，提示Ⅱ型PRRSV的糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒的感染性是非必需的。作者對(duì)GenBank上的GP2a通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ型PRRSV自然毒株中，存在著N184位點(diǎn)糖基化位點(diǎn)缺失的分離株（primepac株），暗示著N184位點(diǎn)糖基化對(duì)病毒的感染性是非必需的［4］。

2.1.2 E蛋白 小囊膜蛋白E是由ORF2b編碼的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，由70（Ⅰ型）或73（Ⅱ型）個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為10ku。無(wú)潛在的糖基化位點(diǎn)，但N端有肉豆蔻基化位點(diǎn)和酪蛋白Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，研究表明E蛋白豆蔻?；瘜?duì)病毒的感染性是非必需的，但是能促進(jìn)病毒的增殖［5］。E蛋白含有2個(gè)半胱氨酸（cys48和cys54），但E蛋白不能形成二硫鍵連接的同源二聚體。Lee C等［6－7］報(bào)道稱，E蛋白鑲嵌在病毒囊膜中，可能具有離子通道的作用，能促進(jìn)病毒在感染過(guò)程中脫殼完成基因組釋放過(guò)程。

2.1.3 GP3 GP3為ORF3編碼的高度糖基化蛋白，分子質(zhì)量為45ku～50ku，含265（Ⅰ型）或254（Ⅱ型）個(gè)氨基酸。GP3是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，在Ⅰ型與Ⅱ型PRRSV毒株間只有55%的氨基酸同源性，而且多數(shù)變異發(fā)生在N末端。Ⅱ型PRRSV GP3的C端比Ⅰ型PRRSV的少12個(gè)氨基酸，而C端又是一個(gè)高變區(qū)，含有兩型特異的抗原表位，可能參與病毒的中和作用。Ⅱ型PRRSV的GP3最初被認(rèn)為是一個(gè)可溶性的分泌蛋白，不屬于結(jié)構(gòu)蛋白的成分。之后的研究證實(shí)Ⅱ型PRRSV的GP3與Ⅰ型PRRSV一樣作為病毒粒子的小囊膜蛋白［8］。

GP3具有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)在歐、美兩型分離株間非常保守。已經(jīng)證實(shí)，GP3的前6個(gè)糖基化位點(diǎn)是確實(shí)存在的，最后一個(gè)潛在位點(diǎn)是未被糖基化的。并且GP3的N42、N50和N131位糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒粒子的產(chǎn)生是必需的，而其他3個(gè)非必需的糖基化位點(diǎn)影響病毒粒子的生長(zhǎng)特性［3］。研究表明，GP3N131糖基化與病毒的免疫逃避有關(guān)，缺失N131糖基化位點(diǎn)，突變對(duì)高免血清易感，同時(shí)也能夠激發(fā)豬體產(chǎn)生高水平的中和抗體［9］。

2.1.4 GP4 GP4分子質(zhì)量為31ku～35ku，由183（Ⅰ型）或178（Ⅱ型）個(gè)氨基酸組成，為典型的Ⅰ型跨膜蛋白，包含N端和C端強(qiáng)疏水區(qū)，含有4個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。GP4任意一個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變都不影響病毒粒子的拯救，但突變病毒的滴度比親本毒高，可能是更有利于多聚糖蛋白復(fù)合體的形成或突變病毒與細(xì)胞受體結(jié)合。但任意兩個(gè)或更多糖基化位點(diǎn)的突變對(duì)病毒都是致死性的。GP4的糖基化位點(diǎn)也影響其與CD163的結(jié)合從而決定病毒粒子能否進(jìn)入宿主細(xì)胞。GP4單個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變能夠拯救出感染性病毒粒子，因此認(rèn)為單個(gè)糖基化位點(diǎn)突變的GP4蛋白可以與CD163分子有效結(jié)合，但是突變2個(gè)以上糖基化位點(diǎn)的GP4蛋白不能與CD163分子有效結(jié)合，因此其他糖基化位點(diǎn)對(duì)GP4與CD163分子的結(jié)合起重要作用。此外，GP4蛋白在介導(dǎo)與其他糖基化蛋白的相互作用從而形成病毒復(fù)制所必需的多聚蛋白復(fù)合體中發(fā)揮重要功能［3］。

GP2a、GP3和GP4之間通過(guò)非共價(jià)結(jié)合形成三聚體，同時(shí)與E蛋白具有相互作用；且GP5與GP4具有強(qiáng)烈的相互作用，GP5與M蛋白通過(guò)二硫鍵形成異源二聚體，這些蛋白通過(guò)相互作用形成多聚蛋白復(fù)合體，進(jìn)而參與病毒粒子的組裝。GP4與所有的糖基化蛋白相互作用，在GP4存在的情況下，GP2a、GP3可以通過(guò)與GP4的互作間接與GP5結(jié)合，因此認(rèn)為GP4是介導(dǎo)多聚蛋白復(fù)合體形成的關(guān)鍵蛋白。此外，GP2a、GP4的糖基化位點(diǎn)不能保護(hù)病毒逃避宿主抗體的中和作用［3］。雖然LV株GP4蛋白具有中和表位，但血清的中和抗體效價(jià)與GP4抗體的出現(xiàn)似乎沒(méi)有相關(guān)性，其中和作用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于GP5的抗體，因此GP4在誘導(dǎo)中和抗體方面的意義還不明確。

2.1.5 5a蛋白 5a蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的在動(dòng)脈炎病毒中普遍存在的第8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，PRRSV的5a蛋白包括46～51個(gè)氨基酸，EAV包括43～64個(gè)氨基酸。ORF5a的大部分序列與ORF5重疊，它們可能由同一個(gè)亞基因組sgmRNA5轉(zhuǎn)錄，通過(guò)核糖體移碼機(jī)制表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白。Johnson C R等［2］通過(guò)質(zhì)譜分析在高度純化的Ⅱ型PRRSV病毒粒子中檢測(cè)到5a蛋白的存在，但該蛋白在細(xì)胞和病毒粒子中含量很少。

預(yù)測(cè)的5a蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，在Ⅱ型PRRSV 5a蛋白的膜內(nèi)區(qū)有2個(gè)相鄰的半胱氨酸（29和30位），它們可能形成二硫鍵與5a蛋白單體或其它蛋白形成多聚體。5a蛋白C端有一個(gè)在動(dòng)脈炎病毒中保守的RQ基元，認(rèn)為能與RNA結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA的剪接與轉(zhuǎn)運(yùn)。Firth A E等［10］通過(guò)突變EAV ORF5a起始密碼子從而阻止5a蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)突變病毒比親本毒的生長(zhǎng)滴度降低了2個(gè)log，且空斑形態(tài)減小，因此認(rèn)為5a蛋白與動(dòng)脈炎病毒RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和包裝的高效性有關(guān)。Han W等［11］將JXA－1傳至第80代，在 ORF5a內(nèi)部 ORF5之前有4個(gè)氨基酸的插入，表明5a蛋白胞外區(qū)的長(zhǎng)度改變不影響5a蛋白的功能。研究證明，在Ⅱ型PRRSV感染的細(xì)胞及豬體內(nèi)，均能檢測(cè)到5a蛋白及針對(duì)5a蛋白的抗體，但是產(chǎn)生的抗體較少，因此5a蛋白可能主要介導(dǎo)的是細(xì)胞免疫［12］。

5a蛋白的發(fā)現(xiàn)為動(dòng)脈炎病毒的免疫學(xué)及藥理學(xué)研究提供了潛在的靶點(diǎn)，而對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)需要更加深入的研究。

2.2 主要囊膜蛋白

2.2.1 GP5 GP5是病毒粒子中最豐富的糖蛋白，含有200（Ⅱ型）或201（Ⅰ型）個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為25ku。經(jīng)預(yù)測(cè)，N端是一段31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，形成三次跨膜結(jié)構(gòu)，膜外區(qū)由30個(gè)氨基酸組成，C端的50～72個(gè)氨基酸為膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。對(duì)不同毒株P(guān)RRSV GP5蛋白的氨基酸和核苷酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)GP5有1個(gè)高變區(qū)（32aa～40aa）、2個(gè)多變區(qū)（57aa～70aa和121aa～130aa）、3個(gè)保守區(qū)（41aa～56aa，71aa～120aa，131aa～200aa）和2～4個(gè)糖基化位點(diǎn)。

GP5的糖基化位點(diǎn)及程度在病毒復(fù)制過(guò)程中的作用尚不清楚。Osorio實(shí)驗(yàn)室對(duì)經(jīng)典北美型PRRSV GP5的3個(gè) N－糖基化位點(diǎn) （N34、N44、N51）進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn) N33、N55、N33／N55的糖基化降低了病毒的生長(zhǎng)滴度，對(duì)抗體的敏感性也增強(qiáng)，但該脫糖化病毒卻可以激發(fā)比野毒株產(chǎn)生更高水平的中和抗體，表明GP5膜外區(qū)的多糖的缺失能夠提高病毒對(duì)抗體的中和能力和其附近中和表位B的免疫原性。同時(shí)，該研究中N44糖基化位點(diǎn)的脫糖基化卻導(dǎo)致全長(zhǎng)cDNA不能拯救出病毒，說(shuō)明N44位點(diǎn)對(duì)該株病毒的復(fù)制過(guò)程起關(guān)鍵作用。但是，自然毒株中，也存在著較多的N44位糖基化位點(diǎn)缺失的突變毒株，說(shuō)明了該研究中的N44位點(diǎn)氨基酸的改變（或者可能改變了GP5a的蛋白序列）導(dǎo)致了突變克隆未能拯救出病毒。對(duì)歐洲型PRRSV的N46糖基化位點(diǎn)（相對(duì)應(yīng)于Ⅱ型PRRSV N44）進(jìn)行突變能夠拯救出病毒也間接的說(shuō)明了這一點(diǎn)，但該糖基化位點(diǎn)突變對(duì)病毒顆粒的產(chǎn)生和病毒粒子的感染性都有較大影響［3］。其原因可能是失去了寡糖的GP5蛋白不能正確折疊，病毒與受體的相互作用減弱，降低了病毒的特異的感染性。通過(guò)對(duì)PRRSV自然分離株N44株（GP5N44糖基化位點(diǎn)自然缺失）研究也發(fā)現(xiàn)，與VR2332相比，該毒株的N44位點(diǎn)缺失未能提高病毒對(duì)抗體的易感性，且GP5中和表位B的免疫原性卻顯著降低，免疫豬后41d才能產(chǎn)生中和抗體［13］。但該研究沒(méi)能闡明中和表位免疫原性降低是由于N44位點(diǎn)糖基化位點(diǎn)缺失還是中和表位附近的氨基酸不同（與VR2332相比），且與通過(guò)重組腺病毒表達(dá)突變N44糖基化位點(diǎn)的GP5免疫鼠的研究結(jié)果相矛盾［14］。

GP5蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，表面存在對(duì)于抗感染很重要的中和表位。用豬多克隆抗血清和單克隆抗體鑒定了GP5有1個(gè)非中和表位A（27aa～30aa）和1個(gè)中和表位B（37aa～45aa）。表位B在PRRSV分離株中高度保守，但不是免疫優(yōu)勢(shì)表位，在PRRSV感染后期才出現(xiàn)抗表位B的中和抗體。而表位A具有高變異性，具有免疫優(yōu)勢(shì)，在PRRSV感染早期即可出現(xiàn)抗該表位的抗體。因此認(rèn)為非中和表位A作為一個(gè)誘騙表位延遲了中和抗體產(chǎn)生的時(shí)間。存在于表位B周圍的N－多糖能夠降低GP5中和決定簇的免疫原性，可見誘騙表位和具有糖基遮蔽作用的糖基化位點(diǎn)的存在影響了免疫系統(tǒng)對(duì)中和表位的識(shí)別。

此外，GP5蛋白在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其N端的118個(gè)氨基酸對(duì)于保持GP5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性必不可少［15］。

2.2.2 M蛋白 基質(zhì)蛋白（M）是由ORF6編碼的非糖基化膜蛋白，分子質(zhì)量約18ku～19ku，北美株和歐洲株分別含有174和173個(gè)氨基酸。M蛋白在所有的PRRSV株間都是最為保守的結(jié)構(gòu)蛋白，其N端有3個(gè)明顯的疏水區(qū)（17aa～88aa），形成3次跨膜。M蛋白聚集在其感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)二硫鍵與GP5形成異源二聚體，參與病毒粒子的形成。

M蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，感染后10d即可以檢測(cè)該抗體應(yīng)答，因此檢測(cè)M蛋白的抗體可以作為PRRSV感染的診斷與監(jiān)測(cè)指征。表達(dá)的重組M蛋白可以作為血清學(xué)試驗(yàn)的靶抗原，Jiang W等［14］構(gòu)建的同時(shí)表達(dá)GP5和M蛋白的腺病毒重組病毒（Ad－GP5－M）在小鼠體內(nèi)有很好的免疫效果，并且研究表明M蛋白可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)和提高中和抗體產(chǎn)生來(lái)增強(qiáng)抗GP5的免疫反應(yīng)。

2.3 PRRSV細(xì)胞受體結(jié)合蛋白與細(xì)胞表面受體

PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性（cellular tropism）。在體內(nèi)，PRRSV僅能感染單核／巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞；在體外，PRRSV只能感染非洲綠猴腎細(xì)胞系MA104及其衍生細(xì)胞系 Marc－145；但將PRRSV的基因組RNA轉(zhuǎn)染非容許性 （non－permissive）細(xì)胞，如BHK－21和Vero細(xì)胞，病毒能夠在非容許性細(xì)胞系中進(jìn)行生產(chǎn)性感染（productive infection）；通過(guò) 聚 乙 二 醇 （polyethylene glycol，PEG）介 導(dǎo)PRRSV粒子進(jìn)入非容許性細(xì)胞后，病毒可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并產(chǎn)生感染性病毒粒子。以上研究說(shuō)明了病毒的囊膜蛋白在介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體結(jié)合進(jìn)而入侵細(xì)胞的過(guò)程起到重要的作用［16］。

迄今為止，PRRSV入侵的細(xì)胞受體及與其結(jié)合的病毒囊膜蛋白尚存在爭(zhēng)議。初步研究發(fā)現(xiàn)，存在于豬肺泡巨噬細(xì)胞（pig alveolar macrophage，PAM）表面上有3種可能的細(xì)胞受體，包括硫酸乙酰肝素（heparan sulphate，Hs）、唾液酸黏附素（sialodhesin，Sn）和CD163。究竟哪種分子是介導(dǎo)病毒吸附（adsorption）的細(xì)胞受體（receptor）？這個(gè)問(wèn)題在歐洲和美國(guó)學(xué)者之間爭(zhēng)議頗大。美方證據(jù)表明CD163為PRRSV的細(xì)胞受體，主要依據(jù)是，Marc－145表面不表達(dá)Sn，但其卻是惟一的體外傳代細(xì)胞系；PAM和 Marc－145細(xì)胞表面均表達(dá)受體CD163；CD163能夠賦予非容許性細(xì)胞復(fù)制PRRSV的能力，將表達(dá)的CD163的載體轉(zhuǎn)染到非容許性細(xì)胞系BHK－21、Vero和PK－15等細(xì)胞，病毒通過(guò)與CD163的作用來(lái)侵入這些細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，這個(gè)過(guò)程不需要Hs和Sn等分子的存在。而歐方則認(rèn)為Hs、Sn和CD163分子分別在介導(dǎo)病毒結(jié)合（binding）、內(nèi)化（internalization）和 脫 殼 （uncoating）釋 放 基 因 組RNA到胞漿中進(jìn)行復(fù)制的過(guò)程中起重要作用。在這個(gè)過(guò)程中，PAM表面的Hs與病毒的M蛋白結(jié)合，使病毒粒子在細(xì)胞表面聚集，接著Sn通過(guò)與病毒的GP5／M復(fù)合物相互作用來(lái)介導(dǎo)病毒內(nèi)化（internalization）進(jìn)入披網(wǎng)格蛋白囊泡（clathrin－coated vesicles），在CD163的作用下，在酸化了的囊泡中釋放病毒的RNA，從而完成病毒入侵。換言之，CD163并非病毒受體，而是作為一個(gè)輔助病毒顆粒脫殼釋放基因組的因子［17－18］。另一方面，在充分有力的試驗(yàn)證據(jù)證明CD163是PRRSV受體的前提下，Das等證實(shí)了與CD163結(jié)合的病毒囊膜蛋白為GP2a和GP4形成的復(fù)合體，GP2a和GP4表面的糖原可有效的促進(jìn)病毒蛋白和受體的結(jié)合［19－20］。需要指出的是，由于兩個(gè)研究小組所認(rèn)定的細(xì)胞受體不一樣，所鑒定的相對(duì)應(yīng)的病毒的細(xì)胞受體結(jié)合蛋白也不一致。換言之，究竟何種結(jié)構(gòu)蛋白或復(fù)合體行使PRRSV細(xì)胞結(jié)合蛋白（viral attachment protein）目前尚無(wú)定論。在這些研究之前，Dobbe等在EAV感染性克隆的基礎(chǔ)上，將GP5和M蛋白的膜外區(qū)替換為PRRSV的相對(duì)應(yīng)蛋白的膜外區(qū)，發(fā)現(xiàn)GP5和M蛋白的膜外區(qū)并不影響病毒的細(xì)胞嗜性，暗示著GP5和M蛋白不是細(xì)胞受體結(jié)合蛋白。

2.4 N蛋白

核衣殼蛋白（N蛋白）是由ORF7編碼的一種堿性磷酸蛋白，分子質(zhì)量為15ku，是病毒粒子中含量最豐富的蛋白，大約占病毒粒子的40%。N蛋白在歐美兩型毒株間相對(duì)比較保守，分別包括128和123個(gè)氨基酸。N蛋白是病毒最主要的抗原組分，具有極強(qiáng)的免疫原性，機(jī)體最早產(chǎn)生的是N蛋白的抗體，但為非中和抗體，對(duì)機(jī)體無(wú)保護(hù)作用。

成熟的病毒粒子中N蛋白以二聚體的形式存在，研究表明23位的Cys介導(dǎo)形成的N－N同源二聚體對(duì)于病毒的感染性是必需的。N蛋白的N端存在一個(gè)RNA結(jié)合域，此區(qū)域富含堿性氨基酸且高度靈活，有助于其和基因組RNA的相互作用，N蛋白最重要的功能即是與基因組RNA結(jié)合完成病毒粒子的裝配過(guò)程。此外，該區(qū)域參與蛋白與核酸或其他蛋白的結(jié)合，起著分子識(shí)別、分子組裝和蛋白修飾等功能［21］。

PRRSV復(fù)制過(guò)程發(fā)生于感染細(xì)胞的細(xì)胞漿，但N蛋白卻可以同時(shí)定位于細(xì)胞漿與細(xì)胞核［22］。PRRSV N蛋白含有兩段保守的堿性氨基酸，即10～13位和41～47位，分別符合典型核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）的“pat4”和“pat7”基序，稱為NLS－1和NLS－2。N端1～14位氨基酸的刪除并不影響N蛋白的核定位，因此NLS－1可能是一個(gè)隱含的核定位信號(hào)［23］。通過(guò)對(duì)NLS－2的氨基酸替換，確定了KKNKK是NLS－2的核心序列，且43和44位的賴氨酸足以使N蛋白定位到細(xì)胞核中［24］。為了研究N蛋白核定位的生物學(xué)功能，Lee C等［22］將NLS序列中43和44位的兩個(gè)關(guān)鍵的賴氨酸突變成甘氨酸，證明NLS突變不影響子代病毒的產(chǎn)生，但突變病毒滴度降低。用NLS突變病毒接種豬能產(chǎn)生較高的中和抗體，但檢測(cè)到的NLS序列都發(fā)生了回復(fù)突變，回復(fù)突變使N蛋白重新定位到細(xì)胞核，說(shuō)明N蛋白的NLS位點(diǎn)在體內(nèi)有很強(qiáng)的選擇壓力。Pei Y等［25］通過(guò)刪除或替換構(gòu)建了9個(gè)NLS突變體，大部分突變體影響了N蛋白在細(xì)胞核的定位，且突變病毒體外接種豬都產(chǎn)生了高于野生型滴度的中和抗體，表明N蛋白的細(xì)胞核定位可能與PRRSV在體內(nèi)的致病性及宿主應(yīng)答有關(guān)。Tan F等［26］通過(guò)構(gòu)建一系列的缺失及突變感染性克隆，證明Ⅱ型PRRRSV N蛋白N端5～13、39～42、48～52位氨基酸及C端最后4個(gè)氨基酸都是非必需的，這些氨基酸的缺失并不影響病毒粒子的感染性。有趣的是，其中5～13、39～42正好分別位于NLS－1和NLS－2功能域。關(guān)于N蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的功能，目前還沒(méi)有明確的答案，但在冠狀病毒中已經(jīng)證明N蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中可以通過(guò)抑制細(xì)胞分裂而調(diào)控宿主細(xì)胞的復(fù)制。在PRRSV中，Yoo D等［24］證明N蛋白能夠與28S和18S核糖體RNA相互作用，且能夠與細(xì)胞核中的核仁纖維蛋白相互作用?？傊琋蛋白可能通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞的功能來(lái)調(diào)節(jié)自身的復(fù)制，但是具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)PRRSV的基因組結(jié)構(gòu)及其編碼的蛋白有了更加全面的認(rèn)識(shí)。反向遺傳操作技術(shù)（reverse genetic manipulation，RGS）的發(fā)展，為研究病毒單個(gè)基因在病毒復(fù)制過(guò)程中的作用提供了平臺(tái)。RGS技術(shù)已用于PRRSV結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白特性的研究，利用RGS來(lái)研究結(jié)構(gòu)蛋白的特性及開發(fā)新型疫苗將成為未來(lái)的研究方向。

［1］劉 準(zhǔn)，王鳳雪，武 華.豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（12）：120－124.

［2］Johnson C R，Griggs T F，Gnanandarajah J，et al.Novel structural protein in porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded in an alternative open reading frame 5 present in all arteriviruses［J］.J Gen Virol，2011，92（5）：1107－1116.

［3］Wissink E H，Kroese M V，Maneschijn－Bonsing J G，et al.Significance of the oligosaccharides of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus glycoproteins GP2and GP5for infectious virus production［J］.J Gen Virol，2004，85（12）：3715－3723.

［4］Tian D，Zheng H，Zhang R，et al.Chimeric porcine reproductive and respiratory syndrome viruses reveal full function of genotype 1envelope proteins in the backbone of genotype 2［J］.Virology，2011，412（1）：1－8.

［5］Du Y，Zuckermann F A，Yoo D.Myristoylation of the small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus is non－essential for virus infectivity but promotes its growth［J］.Virus Res，2010，147（2）：294－299.

［6］Lee C，Yoo D.The small envelope protein of porcine reproductive and resporatory syndrome virus possessesion channel protein－like properties［J］.Virology，2006，355（1）：30－43.

［7］李 勇，夏志平，高英杰，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白2b研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（10）：99－101.

［8］De Lima M，Ansari I H，Osorio F A.GP3is a structural component of the PRRSV type II（US）virion ［J］.Virology，2009，390（1）：31－36.

［9］Hiep L X，KwonB，Yoon K J，et al.Immune evasion of porcine reproductive and respiratory syndrome virus through glycan shielding involves both glycoprotein 5as well as glycoprotein［J］.J Virol，2011，85（11）：5555－5564.

［10］Firth A E，Zevenhoven－Dobbe J C，Wills N M，et al.Discovery of a small arterivirus gene that overlaps the GP5coding sequence and is important for virus production［J］.J Gen Virol，2011，92（5）：1097－1106.

［11］Han W，Wu J J，Deng X Y，et al.Molecular mutations associated with the in vitro passage of virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Virus Genes，2009，38（2）：276－284.

［12］Jeong H J，Song Y J，Lee S W，et al.Comparative measure－ment of cell－mediated immune responses of swine to the M and N proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clin Vac Immunol，2010，17（4）：503－512.

［13］Faaberg K S，Hocker J D，Erdman M M，et al.Neutralizing antibody responses of pigs infected with natural GP5N－glycan mutants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Viral Immunol，2006，19（2）：294－304.

［14］Jiang W，Jiang P，Ma S，et al.Recombinant adenovirus expressing GP5and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cellmediated immune responses in mice［J］.Vet Immunol Immunopathol，2006，113（1－2）：169－180.

［15］Fernandez A，Suarez P，Diaz－Guerra M，et al.Characterization of regions in the GP5protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus required to induce apoptotic cell death［J］.Virus Res，2002，83（1－2）：103－118.

［16］Van Breedam W，Delputte P L，Van Gorp H，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage［J］.J Gen Virol，2010，91（7）：1659－1667.

［17］Van Breedam W，Van Gorp H，Zhang J Q，et al.The M／GP（5）glycoprotein complex of porcine reproductive and respiratory syndrome virus binds the sialoadhesin receptor in a sialic acid－dependent manner［J］.PLoS Pathog，2010，6（1）：e1000730.

［18］Van Gorp H，Van Breedam W，Delputte P L，et al.Sialoadhesin and CD163join forces during entry of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Gen Virol，2008，89（12）：2943－2953.

［19］Das P B，Vu H L，Dinh P X，et al.Glycosylation of minor envelope glycoproteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infectious virus recovery，receptor interaction，and immune response［J］.Virology，2011，410（2）：385－394.

［20］Das P B，Dinh P X，Pattnaik A K.The minor envelope glycoproteins GP2aand GP4of porcine reproductive and respiratory syndrome virus interact with the receptor CD163［J］.J Virol，2010，84（4）：1731－1740.

［21］譚菲菲，韋祖樟，袁世山.套式病毒目病毒核衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（9）：984－988.

［22］Lee C，Hodgins D，Calvert J G，et al.Mutations within the nuclear localization signal of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein attenuate virus replication［J］.Virology，2006，346（1）：238－250.

［23］Rowland R R，Schneider P，F(xiàn)ang Y，et al.Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus［J］.Virology，2003，316（1）：135－145.

［24］Yoo D，Wootton S K，Li G，et al.Colocalization and interaction of the porcine arterivirus nucleocapsid protein with the small nucleolar RNA－associated protein fibrillarin［J］.J Virol，2003，77（22）：12173－12183.

［25］Pei Y，Hodgins D C，Lee C，et al.Functional mapping of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus capsid protein nuclear localization signal and its pathogenic association［J］.Virus Res，2008，135（1）：107－114.

［26］Tan F，Wei Z，Li Y，et al.Identification of non－essential regions in nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for replication in cell culture［J］.Virus Res，2011，158（1－2）：62－71.