豬偽狂犬病病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展＊

郭廣君，呂素芳，肖躍強(qiáng)，畢研麗，魏 鳳，，沈志強(qiáng)，，丁 壯

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）也稱(chēng)為豬I型皰疹病毒（Suis herpesvirus 1）或 Aujeszky＇s病毒，它與人單純皰疹病毒（HSV－1、HSV－2）和水痘帶狀皰疹病毒（VZV）、牛皰疹病毒1型（BHV－1）、馬皰疹病毒1型（EHV－1）以及雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）同屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）的α皰疹病毒亞科，其宿主范圍很廣，能有效感染除高級(jí)靈長(zhǎng)類(lèi)外的哺乳動(dòng)物和一些禽類(lèi)，豬是其自然宿主和傳染源之一。PRV能引起多種家畜及野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（除豬外）和腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病，并可在豬體內(nèi)建立潛伏感染。

隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)日臻完善，豬偽狂犬病的現(xiàn)代疫苗研究有了長(zhǎng)足的發(fā)展，相關(guān)的血清學(xué)方法和分子生物學(xué)診斷方法也不斷完善，本文就近年來(lái)針對(duì)豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)方法做一綜述。

1 血清學(xué)方法

1.1 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)（neutralization test，NT）又稱(chēng)微量血清 中 和 試 驗(yàn) （mircoserum neutralization test，MSNT），作為病毒檢測(cè)的經(jīng)典方法，是世界上多數(shù)國(guó)家診斷PR的法定方法之一。將標(biāo)準(zhǔn)病毒株與連續(xù)倍比稀釋的等量血清混勻后，37℃中和1h，接種在96孔微量培養(yǎng)板上的單層豬腎繼代細(xì)胞（PK－l5）或雞胚成纖維細(xì)胞，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)觀察細(xì)胞病變（CPE），以能完全中和病毒的血清最高稀釋度的倒數(shù)為該血清的中和效價(jià)，中和效價(jià)大于或等于1∶2的判為陽(yáng)性。方六榮等［1］用MSNT進(jìn)行了PRV的血清學(xué)調(diào)查。通過(guò)監(jiān)測(cè)中和指數(shù)和中和效價(jià)，發(fā)現(xiàn)MSNT的特異性很強(qiáng)，但敏感性較低。如果延長(zhǎng)抗原與血清的孵育時(shí)間，尤以補(bǔ)體存在時(shí)，可使其敏感性增高。NT有較高靈敏度，是一種常用的診斷方法。由于該法操作繁瑣，工作量大，且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制，給臨床應(yīng)用帶來(lái)一定的困難。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn) （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）具有快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于大批量樣品的檢測(cè)，IgM－ELISA還可早期檢測(cè)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其作為診斷豬PR的首選血清學(xué)方法。美國(guó)也將ELISA作為PR的3種法定診斷方法之一。

隨著近年來(lái)基因工程缺失疫苗的研制成功，我國(guó)陸續(xù)建立了針對(duì)野毒與疫苗毒株的鑒別診斷方法。唐勇［2］在克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上建立了gG－LAT、gG－ELISA和gE－LAT、gE－ELISA。結(jié)果表明，gGLAT和gG－ELISA特異性強(qiáng)、敏感性高，可用于區(qū)分gG基因缺失疫苗活苗免疫豬與自然感染野毒的血清學(xué)陽(yáng)性豬；gE－LAT和gE－ELISA特異、敏感且重復(fù)性好，能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清，可用于豬偽狂犬病的鑒別診斷。汪招雄等［3］以豬偽狂犬病病毒（PRV）Ea株特異性單克隆抗體576株為捕獲抗體，純化的抗PRV IgG為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)PRV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。結(jié)果表明，雙抗體夾心間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織中PRV的檢測(cè)。Gut M 等［4］構(gòu)建了直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA （gE／gI－ELISA），試驗(yàn)證明gE／gI ELISA比gE－ELISA的敏感性和特異性更強(qiáng)，還可用于檢測(cè)感染2周齡的早期感染豬血清中的抗體。Gut M 等［5］構(gòu)建了直接夾心BacgB ELISA，結(jié)果證明此法具有較高的特異性和敏感性，最早可以檢測(cè)感染7d后豬血清中的gB抗體。感染豬體內(nèi)可以檢測(cè)到母源抗體，還可用于檢測(cè)包括gE缺失在內(nèi)的疫苗毒與自然感染毒。Ao J Q等［6］將畢赤酵母表達(dá)的gE蛋白作為包被抗原，建立了間接gE－ELISA方法，與商業(yè)的gE－ELISA方法相符程度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。羅飛［7］以在大腸埃希菌中高效表達(dá)的偽狂犬病毒gB重組蛋白作為抗原，以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，建立了針對(duì)血清gB抗體的間接gBELISA，該方法敏感性和特異性分別為75%（27／36）和80.7%（67／83），符合率為79%（94／119）。

1.3 乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)（latex agglutination test，LAT）利用抗原抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)，先用乳膠包被抗原，再與相應(yīng)血清反應(yīng)，如幾分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，可判定有PRV感染。唐勇［8］在克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上建立了 gG－LAT、gG－ELISA 和 gE－LAT、gE－ELISA。結(jié)果表明，gG－LAT和gG－ELISA特異性強(qiáng)、敏感性高，可用于區(qū)分gG基因缺失疫苗活苗免疫豬與自然感染野毒的血清學(xué)陽(yáng)性豬；gE－LAT 和gEELISA特異、敏感且重復(fù)性好，能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清，可用于豬偽狂犬病的鑒別診斷。美國(guó)已經(jīng)有商品化的LAT試劑盒供臨床使用，LAT操作簡(jiǎn)單、方便、快速，且敏感性高、特異性強(qiáng)，適用于疫病監(jiān)測(cè)或流行病學(xué)調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽(yáng)性豬初次篩選。

1.4 血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)

吳平等［9］用單克隆抗體致敏綿羊紅細(xì)胞建立了反向間接血凝抑制試驗(yàn)（HI），與MSNT符合率為94%。廖文軍等［10］以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體（ScFv）－PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為抗原，建立了檢測(cè)豬偽狂犬病病毒gE抗體的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。與美國(guó)進(jìn)口的PRV抗體檢測(cè)gE－ELISA診斷試劑盒比較，陰、陽(yáng)性檢出符合率均為100%。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性和特異性較高的特點(diǎn)，可用于PRV野毒感染的快速篩查。

1.5 膠體金免疫層析

白靜等［11］利用PCR技術(shù)從PRV基因組中克隆gE抗原表位基因，將其插入到載體pET－22b（＋）中，構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒，并在E.coliBL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后作為抗原，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用雙抗原夾心法于國(guó)內(nèi)首先建立了豬PRV gE抗體檢測(cè)的免疫層析試紙條。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好，適合豬偽狂犬病的臨床診斷。廖文軍等［12］以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體（ScFv）－PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為診斷抗原和膠體金標(biāo)記物，以羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質(zhì)控帶，制作檢測(cè)PRV gE抗體的雙抗原膠體金試紙條。試紙條在室溫保存6個(gè)月，其特異性和敏感性沒(méi)有明顯變化；與美國(guó)IDEXX和法國(guó)LSI gE－ELISA抗體檢測(cè)診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較，1 164份豬血清的符合率均為90.55%。制備的膠體金試紙條具有操作簡(jiǎn)便、敏感性和特異性較高的特點(diǎn)，可用于PRV野毒感染的快速篩查。

2 分子生物學(xué)方法

2.1 核酸探針

郭萬(wàn)柱等［13］用斑點(diǎn)雜交法應(yīng)用32P標(biāo)記PRV全基因組DNA和重組質(zhì)粒作探針檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中的PRV－DNA，均能檢測(cè)10pg的PRV－DNA且有較高特異性。王琴等［14］以非放射性生物素標(biāo)記DNA探針檢測(cè)偽狂犬病病毒，且與郭萬(wàn)柱報(bào)道的結(jié)果一致。魏偉等［15］用光敏生物素標(biāo)記PRV特異性糖蛋白GP50克隆重組顆粒PUP作為探針，檢測(cè)試驗(yàn)感染乳豬15頭份，證明通過(guò)PCR和分子克隆技術(shù)制備的PRV特異性糖蛋白基因片段的光敏生物探針能有效地用于檢測(cè)偽狂犬病病毒。劉志杰等［16］利用PCR技術(shù)擴(kuò)增gE基因片段，制備了地高辛標(biāo)記的gE基因核酸探針，特異性好，對(duì)PRV野毒的最低檢出量為4pg，敏感性高，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，表明該核酸探針可用于豬偽狂犬病野毒感染的臨床診斷。

2.2 基因芯片

張煥容等［17－18］對(duì)偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和日本腦炎病毒（JEV）檢測(cè)基因芯片的制備及該芯片的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研究。取其中13個(gè)靶基因PRV gB、gG、TK和gE，PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEVC、PrM／M、E、NS1和NS5制備PRV、PPV和JEV檢測(cè)基因芯片，結(jié)果制備的芯片質(zhì)量好，檢測(cè)的靈敏度為3pg／μL，特異性強(qiáng)，芯片可重復(fù)使用，芯片批間重復(fù)性好。該芯片可同時(shí)檢測(cè)PRV、PPV和JEV，可區(qū)分偽狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒。符芳等［19］將豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）的特異cDNA片段作為探針點(diǎn)制于氨基修飾的玻片上，以這5種細(xì)胞毒的核酸作為模板，建立了基因芯片探針檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該芯片探針可以特異地與Cy3標(biāo)記的這5種靶物結(jié)合。用該基因芯片對(duì)100份現(xiàn)場(chǎng)采集的豬全血樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出PRRSV陽(yáng)性樣品26份，PCV－2陽(yáng)性樣品47份，PRRSV和PCV－2混合感染陽(yáng)性樣品17份，PPV陽(yáng)性樣品5份，PRV陽(yáng)性樣品2份，CSFV陽(yáng)性樣品20份。表明研制的cDNA芯片探針可以特異地檢測(cè)這5種豬病病毒，具有良好的診斷應(yīng)用前景。

2.3 PCR方法

2.3.1 多重PCR PCR方法以其快速、敏感、易于操作等優(yōu)點(diǎn)在近年來(lái)被廣泛應(yīng)用，檢測(cè)PRV與其他豬病毒病的多重PCR方法也相繼建立。潘群興等［20］建立了一種同時(shí)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬細(xì)小病毒（PPV）及豬偽狂犬病病毒（PRV）疫苗株與野毒株的多重PCR方法。該方法敏感性較高，特異性好，對(duì)臨床上進(jìn)行這3種疾病的鑒別診斷和混合感染的檢測(cè)具重要意義。曲光剛等［21］建立了PRV、PPV雙重PCR檢測(cè)方法，具有良好的特異性和敏感性，省時(shí)、省力、快速、高效、敏感。岳豐熊［22］建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)PCV－2、PPV、PRV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的多重PCR方法（mPCR）。結(jié)果表明，該方法具有很好的特異性和敏感性，對(duì)臨床上PCV－2、PPV、PRV、PRRSV的鑒別診斷以及這4種病毒的流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。Huang C等［23］建立了快速檢測(cè)PRV、PPV、PCV－1和PCV－2的多重PCR方法，通過(guò)不同PCR組合可以從淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、扁桃體等組織檢測(cè)到一種或多種病毒，敏感性和特異性較高，可作為分子生物學(xué)診斷的常用方法。Lee C S等［24］建立了可同時(shí)檢測(cè)豬體內(nèi)偽狂犬病病毒、細(xì)胞巨化病毒和豬圓環(huán)病毒的多重PCR方法。Yue F等［25］建立了快速檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重PCR方法。多重PCR將成為分子生物學(xué)檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查的常用方法。

2.3.2 實(shí)時(shí)定量 PCR 趙麗等［26－27］根據(jù)豬偽狂犬病病毒gE基因保守序列，建立了實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法。結(jié)果表明，該方法具有快速、特異、敏感、可定量，并可同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。呂建強(qiáng)等［28］根據(jù)GenBank中登錄的偽狂犬病病毒gD基因序列，選擇高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和TaqMan熒光探針，通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了用于檢測(cè)偽狂犬病病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，靈敏性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其最低檢測(cè)限可達(dá)1.42 pg／μL的總DNA，其敏感度比PCR至少高10倍。李明鳳等［29］利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PRV gH基因的187bp片段，建立了SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，該方法具有特異、敏感、快速、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床PRV感染的檢測(cè)。Ma W等［30］根據(jù)PRV gB和gE基因分別設(shè)計(jì)引物和探針，建立了快速檢測(cè)區(qū)分偽狂犬病毒野毒與基因缺失疫苗毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，能快速、特異檢測(cè)感染和潛伏感染野豬體內(nèi)的PRV。Zhao L等［31］根據(jù)PRV gH，gE基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物及相應(yīng)的探針，建立了區(qū)分偽狂犬病野毒與疫苗毒的熒光定量PCR診斷方法，結(jié)果表明，建立的FQ－PCR方法快速、敏感、特異、精確，可廣泛用于PRV野毒檢測(cè)，為早期快速診斷和定量分析PRV的感染程度奠定了基礎(chǔ)。Tombácz D 等［32］建立了實(shí)時(shí)定量RT－PCR方法，從感染PK－15細(xì)胞中提取PRV全基因組檢測(cè)RNA，以一種新的方式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)表達(dá)動(dòng)力學(xué)比較不同的PRV基因并進(jìn)行分類(lèi)，首次通過(guò)qRT2－PCR方法進(jìn)行基因表達(dá)研究皰疹病毒全基因組。

2.3.3 LAMP方法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop－mediated isothermal amplification）是一種新興的快速擴(kuò)增技術(shù)，非常適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。自建立以來(lái)，其在反應(yīng)速度、產(chǎn)物檢測(cè)和引物設(shè)計(jì)等許多方面又得到了進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展，使其性能更優(yōu)異，用途更廣泛。En F X 等［33］根據(jù) PRV 的 DNA－結(jié) 合 蛋 白（DBP）基因設(shè)計(jì)6條引物，建立了檢測(cè)PRV的LAMP方法。最低檢測(cè)量達(dá)10fg DNA，比普通PCR靈敏度高100倍～1 000倍，而且特異性好。采取5份臨床樣品同時(shí)進(jìn)行LAMP和PCR檢測(cè)，相關(guān)性高。Zhang C F等［34］根據(jù)gE基因設(shè)計(jì)一組引物檢測(cè)野毒株，根據(jù)gG或gE基因設(shè)計(jì)另一組引物檢測(cè)gE－疫苗毒和野毒，建立了用于快速檢測(cè)區(qū)別偽狂犬病野毒與基因缺失疫苗毒的LAMP方法。結(jié)果表明，比普通PCR靈敏100倍～1 000倍，具有特 異 性，PPV、PCV－1、PCV－2、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV等豬的病毒未擴(kuò)增出。LAMP方法因其敏感性、特異性、操作簡(jiǎn)單，將成為早期快速鑒別區(qū)分PRV gE缺失疫苗與自然感染野毒的方法。

4 展望

對(duì)病原快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)是防控當(dāng)今威脅畜牧業(yè)各類(lèi)傳染病的關(guān)鍵措施。目前用于PRV感染的診斷方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)。血清學(xué)檢測(cè)手段，尤其是研制成功的LAT和針對(duì)主要抗原蛋白gE、gB、gD建立的ELISA試劑盒操作簡(jiǎn)單、方便，不需要使用昂貴復(fù)雜的儀器，可以在基層組織中廣泛應(yīng)用。特別是近年來(lái)隨著單抗技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)的日臻完善和改進(jìn)，膠體金試紙條研制和LAMP技術(shù)方法的建立與應(yīng)用使基層現(xiàn)場(chǎng)直觀的檢測(cè)成為可能。

分子生物學(xué)方法靈敏度高、特異性好，隨著條件的完善將會(huì)越來(lái)越廣泛應(yīng)用。多重PCR和套式PCR的應(yīng)用提高了檢測(cè)疾病的特異性和敏感性，可以用于大批樣品的檢查和流行病學(xué)調(diào)查；而核酸探針?lè)椒`敏度高，可以達(dá)到pg級(jí)，是目前靈敏度最高的檢測(cè)方法，但是其試驗(yàn)操作步驟較為復(fù)雜而繁瑣，可以用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和判定。當(dāng)然，無(wú)論哪一種方法都不能徹底解決所有的問(wèn)題，可以根據(jù)檢測(cè)的目的和要求，選擇最適宜的檢測(cè)方法或?qū)追N檢測(cè)方法組合起來(lái)應(yīng)用，做到早發(fā)現(xiàn)，力爭(zhēng)從根本上解決該病的防控問(wèn)題。

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