核酸適體及其在疫病診斷中的應(yīng)用*

祖立闖,王金良,李 嬌,沈志強,*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

核酸適體及其在疫病診斷中的應(yīng)用*

祖立闖1,王金良2,李 嬌1,沈志強1,2*

(1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600;2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600)

核酸適體是采用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選出的能與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合的配體。因其具有親和力高、特異性強、精確識別、易體外合成與修飾等優(yōu)點,逐漸成為抗體的代替或補充試劑,已成功應(yīng)用于生物芯片、生物傳感器、分子信標等多種疫病診斷技術(shù)平臺,顯示出了良好的應(yīng)用前景,在未來的疫病診斷中將發(fā)揮越來越重要的作用。論文就適體技術(shù)及其在疫病診斷中的應(yīng)用進展進行綜述。

核酸適體;指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù);疫病診斷

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,人們意識到 DNA和RNA不僅是遺傳信息儲存和傳遞的載體,還可以借自身折疊形成特定的空間結(jié)構(gòu)與其他類型的分子相互作用。指數(shù)擴增富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是20世紀90年代初新出現(xiàn)的一種化學(xué)組合篩選技術(shù),由Tuerk C和Gold L在1990年首次提出[1],從而開啟了一個研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用的嶄新時代[2-3]。SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機寡核苷酸由兩端的固定序列和中間幾十個堿基的隨機序列組成文庫,通過施加選擇壓力,并結(jié)合體外擴增技術(shù),經(jīng)過多輪的循環(huán)選擇富集,獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,長度一般為25個～60個核苷酸[4-5]。SELEX技術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子(aptamer),國內(nèi)將其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識體和核酸適配體等。適體的出現(xiàn),使得篩選能識別各種靶物質(zhì)并能與靶物質(zhì)具有高親和性、高特異性結(jié)合的反應(yīng)物成為可能[6]。20多年來,SELEX技術(shù)得到不斷的發(fā)展和成熟,篩選到的核酸適體不斷被應(yīng)用于生命科學(xué)各個領(lǐng)域的研究中[7-11]。適體在疫病診斷方面的應(yīng)用雖然起步較晚[12],但發(fā)展迅速,本文就適體技術(shù)及其在疫病診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景做一簡要綜述。

1 核酸適體與靶蛋白作用的機理

SELEX首先根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù),人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫,文庫的兩端為固定序列,中間為長度約25個～30個核苷酸隨機序列。寡核苷酸隨機區(qū)的每個核苷酸種類都存在4種可能性(A、C、G、T),如果隨機區(qū)有n個核苷酸,那么隨機序列的多樣性有4n種。隨機區(qū)域長度為30個核苷酸左右的文庫容量就能達到1014-15[13]。單鏈寡核苷酸易通過G-C、A-T配對(RNA中還存在G-U配對)形成各種形狀的極其穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),如發(fā)卡(hairpin)、莖-環(huán)(stem-loop)、G-四聚體(G-tetramer)、假節(jié)(pseudoknot)、鼓包(bulge)等 ,這些結(jié)構(gòu)通過靜電作用、氫鍵作用、構(gòu)型互補等形式與靶物質(zhì)相互作用,或嵌合,或包被,形成穩(wěn)定的核酸-靶物質(zhì)復(fù)合物[3]。適體與配體間具有較大的接觸面積,能形成許多潛在的結(jié)合位點,這一優(yōu)勢使適體甚至能識別配體間一個基團的細微差別,因此其在理論上具有很高的特異性。適體識別蛋白質(zhì)靶序列的過程與抗體類似,不同的是,抗體以初結(jié)構(gòu)去識別抗原決定簇,而適體則折疊成緊密的結(jié)構(gòu),嵌進蛋白質(zhì)表面的裂縫中,這種作用機制就好比蛋白質(zhì)上形成“口袋”,適合該“口袋”的結(jié)構(gòu)嵌進,而其余的結(jié)構(gòu)終將被洗掉[14]。文庫中核苷酸隨機序列的多樣性決定了寡核苷酸立體構(gòu)象的多樣性,容量為1014-15的巨大文庫所蘊含的豐富的核苷酸立體構(gòu)象幾乎模擬了自然界存在的所有可能與靶物質(zhì)相互作用所利用的空間結(jié)構(gòu),因此理論上應(yīng)用SELEX技術(shù)能篩選到自然界幾乎所有靶分子的適體。

2 核酸適體的篩選過程

2.1 建庫

SELEX篩選過程起始于化學(xué)合成的DNA或RNA隨機序列庫,隨機序列兩端是帶有限制性內(nèi)切酶位點的固定序列,此固定序列是多聚酶鏈反應(yīng)及其他酶學(xué)反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點[4.13]。隨機序列不能太短,太短可能導(dǎo)致沒有足夠的二級結(jié)構(gòu)同靶分子結(jié)合;也不能太長,太長可能由于全套文庫單鏈寡核苷酸序列一定,導(dǎo)致降低了選擇分離出來的配基概率。RNA隨機序列庫由DNA序列庫逆轉(zhuǎn)錄而來,如采用 RNA隨機序列庫,預(yù)先應(yīng)將RNA多聚酶啟動子序列(如T7 RNA多聚酶結(jié)合序列)引入5′端固定序列中以便體外逆轉(zhuǎn)錄合成DNA[15]。

2.2 文庫的篩選

在特定緩沖體系和選定的溫度下隨機序列與靶目標混合溫育,此步中可以同靶物質(zhì)親和作用的特異性序列非常少,只有通過物理方法分離出結(jié)合序列。如靶目標是大分子如蛋白質(zhì),通常用硝酸纖維素膜截留與靶蛋白質(zhì)分子結(jié)合的序列;或預(yù)先用生物素修飾靶蛋白質(zhì)分子,再用表面包被有鏈親和霉素的磁珠捕獲核酸-蛋白復(fù)合物。對于小分子靶目標如核酸、多肽等,預(yù)先將其固定到固相支持物上制成親和基質(zhì),通過簡單的洗脫即可以達到純化目的[16]。

2.3 文庫的擴增

侯選序列的DNA片段和 RNA片段,可分別通過PCR或RT-PCR擴增,生成次一級文庫,再開始下一輪篩選。隨著每一輪篩選嚴謹度的不斷增加,低親和力序列逐漸被淘汰。嚴謹度與溫度、pH、金屬離子、靶目標濃度等有關(guān),在每一輪篩選中都應(yīng)進行平行的親和力檢測實驗,最后一輪富集侯選庫中90%以上的序列都是能與靶分子特異結(jié)合的適體序列。約經(jīng)10輪～15輪篩選后,可獲得與靶物質(zhì)特異性高親和力結(jié)合的適體[17]。

2.4 文庫表征與效應(yīng)評價

最后一輪擴增產(chǎn)物進行克隆、測序,并鑒定所篩選的核酸適配子與靶分子結(jié)合的特異性和親和力,也可通過后續(xù)實驗驗證所得適配子與靶分子結(jié)合的最短序列[18]。

3 核酸適體在診斷學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)勢

抗體是目前進行分子識別的主要物質(zhì),廣泛應(yīng)用于疾病的診斷。適體與靶物質(zhì)的結(jié)合類似于抗原-抗體反應(yīng),其功能類似于抗體,但具有抗體無法比擬的優(yōu)越性。

3.1 定量檢測

適體可以對靶物質(zhì)進行定量檢測,凡是涉及抗體的診斷方法,幾乎都可以用適體代替,與抗體可以對抗原進行定量檢測一樣,適體也可以對靶蛋白進行定量檢測[5]。

3.2 作用的靶分子范圍廣

適體作用的靶分子遠多于抗體,原則上自然界中所有物質(zhì)都可以通過SELEX技術(shù)篩選出相應(yīng)的適體,包括金屬離子、有機分子、抗生素、核酸、多肽、蛋白質(zhì)、細胞、病毒顆粒、大分子聚合物等。與抗體相比,適體作為檢測分子應(yīng)用范圍更廣,特別在抗原性弱的蛋白及非純樣品檢測中有明顯優(yōu)勢[2]。

3.3 特異性強

適體的二級結(jié)構(gòu)能夠分辨出靶分子結(jié)構(gòu)上細微的差別,能識別靶物質(zhì)上一個甲基、羥基或一對映結(jié)構(gòu)體的細微結(jié)構(gòu)。適體可能更適用于單克隆抗體難以區(qū)分的結(jié)構(gòu)類似物或交叉抗原的鑒別診斷[12]。

3.4 親和力高

適體的獲得是根據(jù)每一適體與其相對應(yīng)靶物質(zhì)結(jié)構(gòu)的親和力不同而得到的,適體與靶分子間的結(jié)合具有比抗原抗體結(jié)合更高的親和力,它們作用的解離常數(shù)可達nmol甚至pmol水平,可以完全不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾[7]。

3.5 易修飾性

適體為寡聚核苷酸片段,可進精確的位點修飾,且修飾后的適體保持原有的生物學(xué)活性。為了增加適體的功能,提高它在臨床診斷中的應(yīng)用,可以進行廣泛的位點特異性修飾用以提供報告分子和效應(yīng)分子[19]。例如適體可以被熒光素、放射性同位素、生物素標記,還可以與放射性核苷酸、細胞毒素相連。

3.6 穩(wěn)定性好

適體變性與復(fù)性可逆且速度快,變性的適體可在數(shù)分鐘內(nèi)再生,因而可反復(fù)使用,可長期保存和在常溫下運輸,這對診斷試劑都是極其有利的[13]。而抗體易發(fā)生不可逆變性,對溫度敏感需低溫運輸。

3.7 制備容易,周期短

隨著 SELEX技術(shù)的不斷完善和自動化的實現(xiàn),適體的篩選周期越來越短,一個適體的篩選和制備只需2～3個月時間,而制備抗體至少需要3～6個月。篩選出的適體可通過PCR技術(shù)大量擴增,有極佳的準確性和重復(fù)性,幾乎消除了制備的批間差異[5]。

3.8 與靶分子的結(jié)合條件可調(diào)控

適體是在體外篩選的,不需經(jīng)過體內(nèi)(動物、細胞)體系,可根據(jù)實驗要求設(shè)定篩選條件來改變特性,從而實現(xiàn)適體與靶分子結(jié)合條件的調(diào)控。而抗體篩選是在動物體內(nèi)或培養(yǎng)細胞條件下進行的,很難對抗體與靶分子的結(jié)合進行調(diào)控[9]。

3.9 無免疫原性

篩選過程在體外而不在動物體內(nèi)進行,靶物質(zhì)的免疫原性強弱不影響其適體的篩選,適體無免疫原性,體內(nèi)不產(chǎn)生免疫反應(yīng),可用于體內(nèi)診斷[20]。

3.10 分子較小、應(yīng)用靈活

適體(8×103～15×103)比抗體分子小,易于通透細胞膜進入細胞內(nèi),可以檢測細胞內(nèi)的靶分子,可用于細胞內(nèi)診斷[19]。

4 核酸適體在疫病診斷中的應(yīng)用

核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性,使其在疾病診斷中具有良好的應(yīng)用前景,盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報道很少,但應(yīng)用適體檢測靶蛋白的研究卻不斷增多,基于適體的檢測新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。

Horii K等利用SELEX技術(shù)篩選到了針對神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿(sphingosylphosphorylc holine,SPC)且與分磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)無交叉反應(yīng)的特異性RNA適體,為研制基于RNA適體的SPC醫(yī)學(xué)診斷及闡述SPC的生物學(xué)功能提供了有價值的工具[21]。Yoon S篩選到了針對衣殼蛋白的2個RNA適配子,通過電泳遷移率變動分析(EMSA)和表面等離子體共振分析(SPR)表明RNA適配子具有較高的親和力和特異性,且可以中和PCV-2在PK-15細胞的感染,提出中和適體成為PCV-2檢測試劑和抗PCV-2有效治療藥物的候選者[22]。Joshi R等[23]篩選到了5株針對沙門菌的特異性DNA適體,為食品和環(huán)境樣品中沙門菌的檢測提供了基礎(chǔ)。Gopinath S C等[24]篩選到了針對B型流感病毒血球凝集素蛋白的適體,該適體與B型流感病毒血球凝集素蛋白無交叉反應(yīng),為流感病毒的分型診斷提供了基礎(chǔ)。在國內(nèi),李衛(wèi)濱等[25]運用SELEX技術(shù)采用了生物素-鏈親和素磁珠分離法制備次級文庫,從合成的隨機ssDNA文庫中篩選到針對CsA的特異性適體,為小分子物質(zhì)適體的篩選提供一個技術(shù)平臺,也為建立檢測全血CsA濃度的快速而簡便的實驗室診斷方法奠定基礎(chǔ)。王立峰等[26]通過體外7輪篩選獲得癌胚抗原(CEA)特異性適體,證實所獲得的CEA適體可特異性地與純化CEA和天然狀態(tài)的 CEA蛋白結(jié)合,為后續(xù)高表達的CEA腫瘤的靶向診斷和治療奠定了實驗基礎(chǔ)。詹林盛等[27]利用重組的HCV核心蛋白為靶蛋白,從隨機單鏈DNA文庫中篩選出了較強結(jié)合活性的HCV C蛋白特異寡核苷酸適體,并對其結(jié)構(gòu)進行了初步分析,為HCV C蛋白抗原檢測和以C蛋白為靶位的抗HCV治療奠定基礎(chǔ)。馬占忠等[28]建立了以微孔板為篩選介質(zhì),生物素-鏈親和素-辣根過氧化物酶顯色系統(tǒng)測定親和力的方法,該設(shè)計基于較成熟的ELISA技術(shù)之上,操作簡便、易于自動化,具有較好的推廣價值,為MTB的臨床診斷提供了新的思路和方法。甘龍杰等[29]利用SELEX技術(shù),篩選能與金黃色葡萄球菌外毒素B(SEB)特異、高親和力結(jié)合的ssDNA適體(A11),并運用該適體初步建立酶連接適體檢測方法,通過對臨床6例患者血清標本的檢測,得出獲得的ssDNA適體針對SEB的特異性強,能識別SEB患者血清,提出酶連接適體的檢測方法簡便、快速、靈敏,具有很好的應(yīng)用前景。

“三明治夾心法”原用于抗體檢測技術(shù),基于抗體的診斷模式中以雙抗體夾心法最為常用,其中一個抗體為捕捉分子,另一抗體為檢測分子。核酸適體檢測靶物質(zhì)時也可借鑒這種模式。將一個適體的末端交聯(lián)到一個固相上作為“捕獲者”,去捕獲待測標本中的靶物質(zhì),另一個適體的 5′端標有相應(yīng)的指示劑,如:熒光素、生物素、放射性同位素等,這種適體稱之為“報告者”。當“報告者”與相應(yīng)的待測標本結(jié)合后,就會有相應(yīng)的信號產(chǎn)生。Austin M A等[30]將2個適體同時作為捕獲分子和檢測分子進行雙位點結(jié)合實驗。Ahn D G等[31]篩選到了針對SARS N蛋白的 RNA適體,可以特異性的結(jié)合N蛋白C羧基末端,以此適體為捕獲抗原試劑,建立了檢測SARS N蛋白的適體-抗體免疫測定法,可檢測SARS N蛋白最低濃度為2 pg/mL,提出建立的適體-抗體免疫測定法將成為SARS的敏感、特異的檢測方法。Yan X R等[32]利用篩選到的2株RNA適體,建立了檢測細胞因子的酶聯(lián)適體測定法(ELONA),通過與ELISA的對比后發(fā)現(xiàn),ELONA更加敏感、最低檢測下限為100 pg/mL,為細跑因子的檢測提供了極其敏感、特異的檢測方法。

流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)是借助流式細胞儀檢測細胞等單分散顆粒的高通量細胞生物學(xué)分析方法,流式細胞術(shù)檢測時常用熒光標記適體進行染色,以獲得靶標分子的信息,識別不同靶標亞群。以往的流式細胞術(shù)是通過不同顏色的熒光素標記單克隆抗體來實現(xiàn)的,基于抗體流式細胞技術(shù)存在一定局限,抗體分子較大,不易進行細胞內(nèi)結(jié)合,與Fc受體存在非特異性結(jié)合,核酸適體的應(yīng)用可在一定程度解決這些問題,提高檢測的可靠性,促進流式細胞術(shù)檢測的推廣應(yīng)用。Davis K A等[33]首次報道了適體用于流式細胞術(shù)檢測的研究,他們篩選到了與中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,HNE)高親合力結(jié)合適體能象抗HNE熒光標記抗體一樣地有效檢測HNE包被的微珠。證實了適體代替抗體用于流式細胞術(shù)檢測的可行性。

作為有效的生物識別片段,核酸適體在光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器及壓電生物傳感器等多種傳感器檢測平臺上得以應(yīng)用。Lee M等[34]將凝血酶特異性適體應(yīng)用于光纖生物傳感器,縮短了檢測時間,每次檢測不超過15 min。Liss M 等[35]將IgE適體應(yīng)用于石英蛋白生物傳感器,可對IgE定量檢測,并通過傳感器對適體與IgE親和力進行測定,發(fā)現(xiàn)適體能夠耐受反復(fù)的親和洗脫等過程,且傳感器的靈敏度幾乎沒有降低[35]。

分子信標(molecular beacon)是近年發(fā)展起來基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的檢測技術(shù)。Li J J等[36]建立的適體分子信標(moleculptamer beacon,MAB)技術(shù),用于凝血酶檢測。Fang X等[37]將針對血小板來源生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)β鏈的適體兩端分別連接熒光基團和熒光淬滅基團,可以在體液或細胞培養(yǎng)液中檢測到pmol/濃度的PDGF。Bruno J G等[38]篩選到了針對FMDV VP1的特異性適體,并建立了檢測口蹄疫病毒的定量的競爭性熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法,可在10 min內(nèi)定量檢測到臟器內(nèi)25 ng/mL～250 ng/mL的口蹄疫病毒,為口蹄疫的快速診斷提供了一種極其敏感、特異的定量檢測方法。

5 小結(jié)與展望

抗體為臨床檢測和治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ),并且成為目前臨床檢驗不可缺少的部分。隨著SELEX技術(shù)的出現(xiàn),提供了分離能識別各種各樣靶物質(zhì)并對相應(yīng)靶物質(zhì)具有高親和力和特異性寡核苷酸適體的可能性。這些稱之為“適體”的寡核苷酸片段,開始在治療與檢測方面與抗體競爭。凡是涉及抗體的診斷領(lǐng)域,幾乎都可以用適體代替,特別是可以彌補抗體在診斷領(lǐng)域中應(yīng)用的不足。在雙位點結(jié)合試驗?zāi)Ｊ街幸延醒芯勘砻?適體比單克隆抗體更適于難以區(qū)分的結(jié)構(gòu)類似物或交叉免疫反應(yīng)的鑒別診斷;在分子信標模式中,一般分子信標只能用于核酸的檢測,而新建立的適體分子信標可以用于非核酸物質(zhì)如蛋白質(zhì)的檢測。此外,適體在毛細管電泳、流式細胞術(shù)、熒光偏振等分析模式中都發(fā)揮著非常重要的作用;在傳感器方面,與抗體介導(dǎo)的免疫傳感器相比,適體的特點是親和力高、特異性強、靶分子范圍廣、且穩(wěn)定性好、可快速變性復(fù)性、能反復(fù)使用、容易制備、便于長期保存和運輸。

但核酸適體作為診斷試劑仍處于發(fā)展階段,尤其應(yīng)用于體內(nèi)診斷仍有一些問題需要解決,大規(guī)模應(yīng)用還需一段時間;盡管目前還沒有適體毒副作用的報道,但各種修飾適體安全性需要進一步證明。有研究表明,經(jīng)體外篩選獲得的核酸適體在體內(nèi)實驗中可能會失效[39]?？傊?與比較成熟的抗體技術(shù)相比,適體技術(shù)還處在發(fā)展的初級階段,但它正以飛快的速度不斷完善自己。核酸適體作為檢測試劑的市場,將隨著人們對它的不斷認識,開發(fā)前景會越來越好。

[1]Tuerk C,Gold L.Sy stematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].Science,1990,249(4968):505-510.

[2]侯 玥,魏 磊,吳 軍,等.核酸適配子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國實驗診斷學(xué),2010,14(6):965-968.

[3]Djordjevic M.Inferring protein-DNA interaction parameters from SELEX experiments[J].Methods M ol Biol,2010,674:195-211.

[4]Gold L.The SELEX process:a surprising source of therapeutic and diagnostic compounds[J].Harvey Lect,1995-1996,91:47-57.

[5]紅 梅,余若禎,全占軍,等.核酸適配子的研究進展與應(yīng)用展望[J].環(huán)境與健康雜志,2008,25(6):558-560.

[6]Pan W,Clawson G A.Primer-free aptamer selection using a random DNA library[J].Methods Mol Biol,2010,629:369-385.

[7]Fan M,McBurnett S R,Andrews C J,et al.Aptamer selection ex press:a novel method for rapid single-step selection and sensing of aptamers[J].J Biomol Tech,2008,19(5):311-319.

[8]Famulok M,Mayer G.Aptamers as tools in molecular biology and immunology[J].Curr T op Microbiol Immunol,1999,243:123-136.

[9]Zimmermann B,Bilusic I,Lorenz C,et al.Genomic SELEX:a discovery tool for genomic aptamers[J].Methods,2010,52(2):125-132.

[10]Barbas A S,White R R.T he development and testing of aptamers for cancer[J].Curr Opin Investig Drugs,2009,10(6):572-578.

[11]Ulrich H,Wrenger C.Disease-specific biomarker discovery by aptamers[J].Cytometry A,2009,75(9):727-733.

[12]Brody E N,Willis M C,Smith J D,et al.T he use of aptamers in large arrays for molecular diagnostics[J].Mol Diag n,1999,4(4):381-388.

[13]王成剛,莫志宏.核酸適體技術(shù)研究進展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2006,23(2):463-466.

[14]董俊紅,謝立蘋,王振明.SELEX技術(shù)原理及應(yīng)用進展[J].濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,27(5):358-360.

[15]張慧卿,方 念,張 和.適配子篩選技術(shù)[J].中國生物工程雜志,2008,28(1):113-118.

[16]羅正良,嚴鵬科.SELEX技術(shù)及其應(yīng)用的研究進展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2008,46(33):55-57.

[17]Sefah K,Shangguan D,Xiong X,et al.Development of DNA aptamers using Cell-SELEX[J].Nat P rotoc,2010,5(6):1169-1185.

[18]付玉榮,邱宗蔭.SELEX技術(shù)及其應(yīng)用研究進展[J].國外醫(yī)學(xué):病毒學(xué)分冊,2005,12(3):70-72.

[19]嚴馨蕊,高緒文,張智清.與細胞因子特異結(jié)合的寡聚核苷酸適配子及其在診斷和治療中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報,2004,20(4):627-632.

[20]張 貝,部芳玉,張猑和.核酸適配子及其在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2006,33(10):756-759.

[21]Horii K,Omi K,Yoshida Y,et al.Development of a sphingosylphosphory lcholine detection sy stem using RNA aptamers[J].Molecules,2010,15(8):5742-5755.

[22]Yoon S,Lee G,Han D,et al.Neutralization of infectivity of po rcine circovirus ty pe 2(PCV2)by capsid-binding 2'F-RNA aptamers[J].Antiviral Res,2010,88(1):19-24.

[23]Joshi R,Janagama H,Dwivedi H P,et al.Selection,characterization,and application of DNA aptamers for the capture and detection ofSalmonella entericaserovars[J].Mol Cell Probes,2009,23(1):20-28.

[24]Gopinath S C,Kawasaki K,Kumar P K.Selection of RNA-aptamer against human influenza B virus[J].Nucleic Acids Sy mp Ser(Oxf),2005(49):85-86.

[25]李衛(wèi)濱,蘭小鵬,楊湘越,等.SELEX技術(shù)在篩選環(huán)孢霉素A適體中的運用[J].福州總醫(yī)院學(xué)報,2007,14(3):171-173.

[26]王立峰,魏 嘉,殷海濤,等.癌胚抗原特異性寡核苷酸適配子的體外篩選及其意義[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2007,20(9):903-907.

[27]詹林盛,孫紅琰,彭劍淳,等.丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸適配子的篩選與鑒定[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2002,22(5):578-581.

[28]馬占忠,秦蓮花,王玉炯,等.結(jié)核分枝桿菌 ESAT-6抗原適體的篩選與親和性分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2007,10(1):45-48.

[29]甘龍杰,蘭小鵬,江 麗,等.金黃色葡萄球菌外毒素 B特異性適體的篩選及其應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2010,21(2):232-235.

[30]Austin M A,T almud P J,Farin F M,et al.Association of apolipoprotein A5 variants with LDL particle size and triglyceride in Japanese Americans[J].Biochim Biophys Acta,2004,1688(1):1-9.

[31]Ahn D G,Jeon I J,Kim J D,et al.RNA aptamer-based sensitive detection of SARS coronavirus nucleocapsid protein[J].Analy st,2009,134(9):1896-1901.

[32]Yan X R,Gao X W,Yao L H,et al.Novel methods to detect cytokines by enzyme-linked oligonucleotide assay[J].Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2004,20(5):679-682.

[33]Davis K A,Abrams B,Lin Y,et al.Use of a high affinity DNA ligand in flowcytometry[J].Nucleic Acids Res,1996,24(4):702-706.

[34]Lee M,Walt D R.A fiber-optic microarray biosensor using aptamers as receptors[J].Anal Biochem,2000,282(1):142-146.

[35]Liss M,Petersen B,Wolf H,et al.An aptamer-based quartzcry stal protein biosensor[J].Anal Chem,2002,74(17):4488-4495.

[36]Li JJ,Fang X,Tan W.M olecular aptamer beacons for realtime protein recognition[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,292(1):31-40.

[37]Fang X,Sen A,Vicens M,et al.Synthetic DNA aptamers to detect protein molecular variants in a high-throughput fluorescence quenching assay[J].Chem Biochem,2003,4(9):829-834.

[38]Bruno J G,Carrillo M P,Phillips T.Development of DNA aptamers to a foot-and-mouth disease peptide for competitive F RET-based detection[J].J Biomol Tech,2008,19(2):109-115.

[39]Lee D,McClain W H.Aptamer redesigned tRNA is nonfunctional and deg raded in cells[J].RNA,2004,10(1):7-11.

Nucleic Acid Aptamer and Its Application in Disease Diagnosis

ZU Li-chuang1,WANG Jin-liang2,LI Jiao1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.Shandong Lvdu Bio-Sciences and Technology Co.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China;2.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou,Shandong,256600,China)

Nucleic acid aptamers are ligands with high specificity and affinity for their targets,which are screened from large oligonucleotide pools by the systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)technology.For their high specificity and affinity,accurate identification,easily synthesized and modifiedin vitro.Nucleic acid aptamers have become the substitutes or complement antibody reagents,and have been applied in the technology platforms for bio-chips,biosensors,molecular beacons detection,showing a good application,and will play an increasingly important role.In this paper,aptamer technology and its application in disease detection were reviewed.

nucleic acid aptamer;systematic evolution of ligands by exponential enrichment;disease diagnosis

S854.4

A

1007-5038(2011)07-0080-05

2010-11-14

祖立闖(1981-),男,黑龍江賓縣人,碩士,主要從事動物病毒學(xué)研究。*通訊作者