糖基化亞硝基血紅蛋白制備工藝優(yōu)化

劉成國(guó)，陳 瑤，王冬冬，羅 揚(yáng)

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

糖基化亞硝基血紅蛋白制備工藝優(yōu)化

劉成國(guó)1,2，陳 瑤1，王冬冬1，羅 揚(yáng)1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以豬血紅蛋白為原料制備亞硝基血紅蛋白，根據(jù)熱穩(wěn)定性選擇用殼聚糖對(duì)亞硝基血紅蛋白進(jìn)行糖基化。對(duì)糖基化反應(yīng)過(guò)程中亞硝基血紅蛋白與殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例、pH值、加熱溫度和時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物濃度(吸光度)的影響進(jìn)行研究。單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，糖基化亞硝基血紅蛋白制備的最佳工藝條件為亞硝基血紅蛋白與殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例為4.16∶1、pH5.6、加熱溫度50.5℃、時(shí)間15.7min。

血紅蛋白；亞硝基血紅蛋白；殼聚糖；糖基化反應(yīng)

亞硝酸鹽在肉制品加工中作為腌制劑的主要成分發(fā)色劑被廣泛使用，由于其毒性和生成的亞硝胺的強(qiáng)烈致癌性，人們一直致力于尋找替代亞硝酸鹽的方法[1]。在亞硝酸鹽的替代方法研究中，以血紅蛋白為原料生產(chǎn)腌制色素是充分利用畜禽血資源和降低肉制品中亞硝酸鹽殘留量的有效途徑[2]。但國(guó)內(nèi)外現(xiàn)在的亞硝基血紅蛋白類色素的穩(wěn)定性、分散性等加工性質(zhì)尚不理想，提高亞硝基血紅蛋白的穩(wěn)定性和分散性是血紅蛋白類腌制色素在生產(chǎn)中的應(yīng)用關(guān)鍵。因此，對(duì)亞硝酸鹽替代物的研究具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義和學(xué)術(shù)價(jià)值。

蛋白質(zhì)與多糖在一定溫度及相對(duì)濕度等條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)能制取糖基化蛋白，蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)能使其賦予一些新的功能特性，如熱穩(wěn)定性、溶解性、乳化性、分散性、抗氧化性等[3]。Kato等[4]發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)變性溫度下加熱含蛋白質(zhì)和多糖的溶液，可發(fā)生美拉德反應(yīng)，所形成的聚合物具有良好穩(wěn)定性。Matsudomi等[5]研究豬的血漿蛋白與半乳甘聚糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，其共價(jià)復(fù)合產(chǎn)物具有良好的乳化性質(zhì)。糖基化蛋白作為添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)是一個(gè)新的研究領(lǐng)域，由于其穩(wěn)定性、分散性好等特點(diǎn)，可以解決亞硝基血紅蛋白類色素在實(shí)際應(yīng)用中的缺點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于糖基化血紅蛋白制取工藝系統(tǒng)性優(yōu)化研究鮮有報(bào)道，因此，對(duì)糖基化亞硝基血紅蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化研究是糖基化亞硝基血紅蛋白后續(xù)利用的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)以從豬血中提取的血紅蛋白為材料，研究亞硝基血紅蛋白糖基化的最佳反應(yīng)條件，并利用響應(yīng)面確定其最佳工藝條件，從而為豬血的充分利用和新型色素的開(kāi)發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)濱湖市場(chǎng)；檸檬酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、醋酸、檸檬酸、亞硝酸鈉均為分析純；殼聚糖(水分10%，灰分1%，脫乙酰度≥99.0%)上海順強(qiáng)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；LD5-2A型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；pH計(jì) 上海宇隆儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；722可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；78-2型雙向磁力攪拌器 常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血紅蛋白的制備[6]

1.3.1.1 豬血的采集和血細(xì)胞分離

向新鮮豬血中加入0.5%檸檬酸鈉溶液抗凝，與豬血充分混勻，低溫下迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)濾除去雜物。將抗凝血以3000r/min離心15min，收集下部的紅細(xì)胞。用0.9%生理鹽水洗滌紅血球，然后在同樣的轉(zhuǎn)速下離心5min，重復(fù)洗滌兩次，立即裝入塑料瓶中于低溫冰柜中冷凍貯藏(-20℃)。

1.3.1.2 血細(xì)胞的破壁

紅血球使用前于4℃冰箱中存放化凍，同時(shí)起到冷凍破胞的作用。再采用溶脹法，血細(xì)胞與蒸餾水以1∶4比例混合后，磁力攪拌30min，當(dāng)溶液由暗紅轉(zhuǎn)為鮮紅時(shí)，將溶液以3000r/min離心15min，棄去下部沉淀，得血紅蛋白粗提液。

1.3.1.3 血紅蛋白的純化

將破壁的血紅蛋白溶液在避光條件下，于60℃水浴30min，取出后4000r/min離心15min，去除下部變性的雜蛋白，得到純的血紅蛋白溶液。

1.3.2 亞硝基血紅蛋白的制備[7]

取制備的血紅蛋白溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為5%)100mL，加入0.26g NaNO2、0.1g異抗壞血酸鈉和0.05g尼克酰胺，攪拌均勻后以碳酸氫鈉調(diào)整pH6.0，在恒溫60℃條件反應(yīng)20min，取出在3000r/min離心5min，除去沉淀，得到亞硝基血紅蛋白溶液。

1.3.3 糖基化亞硝基血紅蛋白制備中的影響因素

1.3.3.1 殼聚糖和血紅蛋白的相互質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例[8]

分別向不同體積2%的殼聚糖溶液中加入10mL10%亞硝基血紅蛋白溶液，通過(guò)計(jì)算得混合反應(yīng)溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相互比例。設(shè)計(jì)10組兩種溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同比例的試驗(yàn)，見(jiàn)表1。反應(yīng)液調(diào)pH5.5，于50℃水浴條件加熱20min，反應(yīng)過(guò)程中時(shí)常振搖，使其受熱均勻，定容至100mL，產(chǎn)物稀釋相同倍數(shù)于A540下比色，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比反應(yīng)產(chǎn)物的合成效果。

1.3.3.2 pH值的影響

研究表明[9]，蛋白與糖類的一般比例為4∶1。將亞硝基血紅蛋白溶液和殼聚糖溶液的混合液質(zhì)量分?jǐn)?shù)比確定為4∶1，調(diào)整反應(yīng)液pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，后操作同1.3.3.1節(jié)，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳p H值。

1.3.3.3 溫度的影響

將亞硝基血紅蛋白溶液和殼聚糖溶液的混合液質(zhì)量分?jǐn)?shù)比確定為4∶1，反應(yīng)液調(diào)pH5.5，分別于30、40、45、50、60℃條件下加熱后操作同1.3.3.1節(jié)，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.3.3.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

將亞硝基血紅蛋白溶液和殼聚糖溶液的混合液質(zhì)量分?jǐn)?shù)比確定為4∶1，反應(yīng)液調(diào)pH5.5，在50℃水浴條件下分別加熱5、10、15、20、25、30min，后操作同1.3.3.1節(jié)，以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3.5 Box-Benhnken設(shè)計(jì)優(yōu)化糖基化反應(yīng)條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，選擇溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH值3個(gè)對(duì)糖基化反應(yīng)影響顯著的因素為自變量，共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)，以吸光度(A540)為響應(yīng)值，Box-Benhnken試驗(yàn)因素與水平如表2。

表1 亞硝基血紅蛋白與殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例對(duì)糖基反應(yīng)的影響Table 1 Amounts of 2% chitosan added to 10 mL of 10% nitrosohemoglobin for different ratios of nitrosohemoglobin to chitosan

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and their coded levels in Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖和亞硝基血紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

殼聚糖-亞硝基血紅蛋白混合液中亞硝基血紅蛋白與殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例對(duì)糖基化反應(yīng)有著重要的影響，A540為反應(yīng)產(chǎn)物稀釋后的吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同反應(yīng)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例對(duì)糖基化反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響Fig.1 Effect of nitrosohemoglobin-to-chitosan ratio on absorbance at 450 nm of reaction products

由圖1可見(jiàn)，亞硝基血紅蛋白與殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例在2.5～4.16之間時(shí)，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例的提高，吸光度增加，表示產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)比例大于4.16后，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例的提高，產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)降低，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)糖基化反應(yīng)具有顯著影響。此試驗(yàn)最佳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為4.16∶1，與Kato等[4]的研究結(jié)論蛋白與糖類的最適比例一般為4∶1相一致。

2.2 pH值的影響

圖2 pH值對(duì)產(chǎn)物吸光度的影響Fig.2 Effect of pH value on absorbance at 450 nm of reaction products

從圖2可見(jiàn)，當(dāng)pH5.5時(shí)產(chǎn)物濃度最大，當(dāng)pH＞7.5時(shí)，反應(yīng)液開(kāi)始大量產(chǎn)生沉淀，產(chǎn)物濃度急劇下降。pH值的改變會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的解離和帶電性，從而改變蛋白質(zhì)的水合特性[10]。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與pH值有關(guān)，溶液pH值高于或低于等電點(diǎn)pH值時(shí)，由于凈電荷和排斥力的增加使蛋白質(zhì)結(jié)合較多的水，從而有利于防止蛋白質(zhì)變性；從蛋白質(zhì)與多糖之間的靜電作用來(lái)看，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和多糖都帶凈負(fù)電荷時(shí)，一般趨于生成可溶性蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物，此時(shí)，兩者之間相互作用是由蛋白質(zhì)分子上正電荷區(qū)域與陰離子多糖相互吸引所引起[11]。多糖與蛋白質(zhì)上所帶不同電荷的密度越大，越容易發(fā)生靜電作用。本試驗(yàn)最佳pH值在5.5左右，可能正是pH值對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響和對(duì)大分子間相互作用力影響綜合作用的結(jié)果。

2.3 溫度的影響

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物吸光度的影響Fig.3 Effect of temperature on absorbance at 450 nm of reaction products

由圖3可見(jiàn)，隨著反應(yīng)溫度的提高，吸光度呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，反應(yīng)溫度為50℃時(shí)吸光度最大。在試驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)，當(dāng)溫度提高，有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的糖基化亞硝基血紅蛋白濃度就會(huì)提高，在50℃時(shí)其反應(yīng)速度最快，但隨著溫度的進(jìn)一步提高，蛋白質(zhì)變性發(fā)生聚沉現(xiàn)象，降低了溶液中可溶性產(chǎn)物的濃度，從而使得吸光度偏低。有資料報(bào)道，低溫下糖基化反應(yīng)制備的多糖-蛋白共價(jià)復(fù)合物的穩(wěn)定性更優(yōu)[4]。

2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物吸光度的影響Fig.4 Effect of reaction time on absorbance at 450 nm of reaction products

由圖4可見(jiàn)，在50℃加熱溫度下，15min反應(yīng)時(shí)間的效果最好。加熱時(shí)間5min時(shí)，其糖基化反應(yīng)還未完全；反應(yīng)時(shí)間15min時(shí)，其糖基化反應(yīng)達(dá)到平衡，吸光度最大；隨著加熱時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，吸光度越小，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的加熱使得未參與反應(yīng)的熱穩(wěn)定性較差的亞硝基血紅蛋白發(fā)生了熱變性，出現(xiàn)聚沉現(xiàn)象，降低了溶液中產(chǎn)物的濃度，使得吸光度偏低。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化糖基化反應(yīng)條件結(jié)果[12]

根據(jù)表2試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)，按照反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值的具體水平進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental results

由表3可知，中心試驗(yàn)的最佳吸光度(0.620)較單因素試驗(yàn)的最佳吸光度高，分析原因可能是反應(yīng)的亞硝基血紅蛋白溶液見(jiàn)光、遇氧易氧化，4～6h后即開(kāi)始分解，濃度降低，色素吸光度下降[13]，導(dǎo)致隨著時(shí)間的增加，糖基化反應(yīng)響應(yīng)面條件優(yōu)化試驗(yàn)的最佳吸光度比單因素試驗(yàn)的吸光度稍低。

對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值作如下變換：X1＝(Z1-50)/5，X2＝(Z2-15)/5，X3＝(Z3-5.5)/0.5，以吸光度A540為響應(yīng)值(Y)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)順序即試驗(yàn)號(hào)，是Minitab軟件自動(dòng)隨機(jī)化分布的標(biāo)準(zhǔn)序，這樣做最大程度避免了系統(tǒng)誤差，盡可能的保證了試驗(yàn)隨機(jī)化的原則。

表4 方程模型估計(jì)回歸系數(shù)Table 4 Coefficient estimates of the predictive regression for absorbance at 450 nm of reaction products

為使模型更好的反映優(yōu)化條件，模型中仍然保留各項(xiàng)系數(shù)的存在，模型方程如下：

回歸方程中各變量吸光度影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P的值愈小，則相應(yīng)變量的顯著程度愈高。溫度和pH值的P值都小于0.05，表明其對(duì)色素吸光度的影響較顯著，時(shí)間的P值大于0.05，表明其影響不顯著。整體的回歸方程的P值小于0.01，回歸方程是極顯著的。相關(guān)系數(shù)R2＝0.0299/0.0307＝97.31%，說(shuō)明吸光度的變化有97.31%來(lái)源于所選變量，即時(shí)間、溫度和pH值。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用回歸方程確定最佳條件。對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理可得如下3式：

將式(1)、(2)、(3)聯(lián)立方程組，解得X1＝0.106、X2＝0.137、X3＝0.182，代入變換公式，得到反應(yīng)溫度Z1＝50.5℃，反應(yīng)時(shí)間Z2＝15.7min，pH值Z3＝5.6。為了驗(yàn)證二次回歸方程的可靠性，對(duì)方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 二次回歸方程方差分析(ANOVA)Table 5 Analysis of variance of the predictive regression for absorbance at 450 nm of reaction products

由表5可知，在本試驗(yàn)體系中，對(duì)應(yīng)回歸項(xiàng)的P值0.002，表明應(yīng)拒絕原假設(shè)，即可以判斷本模型總體來(lái)說(shuō)是有效的；失擬項(xiàng)中P值為0.199，大于臨界值0.05，表明無(wú)法拒絕原假設(shè)，可以判定本模型并沒(méi)有失擬現(xiàn)象。

根據(jù)擬合函數(shù)，每?jī)蓚€(gè)因素對(duì)吸光度作出響應(yīng)面，圖5～7直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

由圖5可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)和加熱溫度的增加，色素吸光度不斷的增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間和加熱溫度升高到一定程度時(shí)，吸光度(Y)達(dá)到最大；反應(yīng)時(shí)間和加熱溫度繼續(xù)升高時(shí)，吸光度Y值又會(huì)隨之下降。說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短和加熱溫度過(guò)高或過(guò)低都不能使Y值達(dá)到最大值，只有它們?nèi)〉侥硞€(gè)適中值時(shí)，才可使吸光度達(dá)到最大值。

圖5 反應(yīng)溫度(X1)和反應(yīng)時(shí)間(X2)對(duì)吸光度(Y)的影響Fig.5 Response surface plot showing the effects of temperature and reaction time on absorbance at 450 nm of reaction products

圖6 反應(yīng)溫度(X1)和pH值(X3)對(duì)吸光度(Y)的影響Fig.6 Response surface plot showing the effects of temperature and pH value on absorbance at 450 nm of reaction products

圖7 反應(yīng)時(shí)間(X2)和pH值(X3)對(duì)吸光度(Y)的影響Fig.7 Response surface plot showing the effects of reaction time and pH value on absorbance at 450 nm of reaction products

由圖6可知，當(dāng)反應(yīng)溫度較低時(shí)，pH值的增加對(duì)色素的吸光度影響不大。隨著反應(yīng)溫度的升高、pH值的增加，色素的吸光度呈先增大后減少的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)?，在溫度較低的時(shí)候，亞硝基血紅蛋白跟殼聚糖溶液未充分反應(yīng)，p H值的增加對(duì)其反應(yīng)沒(méi)有作用，反而增加到一定的程度發(fā)生了蛋白質(zhì)變性，使得其吸光度下降。隨著反應(yīng)溫度的升高，兩者發(fā)生糖基化反應(yīng)，分子之間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，使其吸光度達(dá)到了最大值。溫度的持續(xù)升高，使反應(yīng)液的蛋白質(zhì)發(fā)生了變性，使得一部分成為沉淀，從而溶液的吸光度降低，即濃度下降。

由圖7可知，當(dāng)pH值較低時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，吸光度先增大后減小。當(dāng)pH值較高時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，吸光度先增大后緩慢減小，但是幅度不大。分析原因可能是反應(yīng)生成的糖基化亞硝基血紅蛋白結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，在最適溫度下隨著時(shí)間的增加其結(jié)構(gòu)不宜破壞，所以吸光度變化的幅度很小。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用亞硝基血紅蛋白與殼聚糖溶液混合后在一定反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH值下反應(yīng)，由于分子間的相互作用形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化糖基化亞硝基血紅蛋白的制備工藝。糖基化反應(yīng)亞硝基血紅蛋白與殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最適比例為4.16∶1。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，回歸方程能較好的預(yù)測(cè)各試驗(yàn)因素與反應(yīng)產(chǎn)物濃度(吸光度)之間的關(guān)系，糖基化亞硝基血紅蛋白制備的最佳工藝條件為亞硝基血紅蛋白與殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例4.16∶1、pH5.6、反應(yīng)溫度50.5℃、反應(yīng)時(shí)間15.7min。

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Optimization of Preparation Process for Glycosylated Nitrosohemoglobin

LIU Cheng-guo1,2，CHEN Yao1，WANG Dong-dong1，LUO Yang1
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China；2. Hunan Provineial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

Nitrosohemoglobin was prepared from porcine hemoglobin and glycosylated with chitosan, which was selected in consideration of thermal stability. The effects of mass ratio of nitrosohemoglobin to chitosan, pH, temperature and reaction time on the glycosylation of nitrosohemoglobin were probed by one-factor-at-a-time method. Subsequently, response surface methodology, based on Box-Benhnken experimental design, was used to optimize pH, temperature and reaction time for achieving maximum absorbance at 450 nm of reaction products. The optimal glycosylation conditions of nitrosohemoglobin were determined as follows∶ mass ratio of nitrosohemoglobin to chitosan, 4.16∶1, pH 5.6, temperature 50.5 ℃ and 15.7 min.

hemoglobin；nitrosohemoglobin；chitosan；glycosylation

TS201.21

A

1002-6630(2011)16-0093-05

2010-10-27

劉成國(guó)(1964—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工及食品質(zhì)量控制。E-mail：lcgwei@126.com