FHIT在乳腺癌中的表達及其與臨床病理指標的關系

王富文 徐國萍 應學翔 林燕蘋 何萍青

脆性組氨酸三聯(lián)體基因(fragile histidine triad gene，F(xiàn)HIT)是1996年由Ohta等［1］用定位克隆及外顯子捕獲技術在人類3號染色體短臂3p14.2首先克隆出來的，其改變主要見于上皮起源的人類惡性腫瘤，以缺失為主。作為腫瘤抑制基因，它的缺失或失活將導致腫瘤的發(fā)展和惡性度的升高。乳腺癌FHIT基因結構或表達異常在國外已有報道，研究表明，F(xiàn)HIT在人類許多腫瘤組織或細胞系中呈現(xiàn)高頻率異常［2］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。乳腺癌的發(fā)生往往經歷1個從上皮增生、不典型增生、原位癌，最終發(fā)展成浸潤癌的過程［3］，而FHIT蛋白與乳腺癌傳統(tǒng)預后指標及其它生物學指標的關系尚不十分清楚。本課題通過研究Fhit蛋白在乳腺良、惡性疾病組織中的表達，并對其與乳腺癌臨床病理指標之間的關系進行分析，來評估FHIT在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集上海市第六人民醫(yī)院2009年8月～2010年8月經穿刺活檢或外科手術切除且經病理檢查確診的具有完整臨床病理資料的女性乳腺手術標本96例，其中以42例浸潤性導管癌、8例導管內癌作為惡性組，年齡35～85歲(中位年齡56歲)，術前均未行化療、放療和(或)內分泌治療。以另外16例導管上皮不典型增生、30例乳腺病作為良性對照組。

1.2 免疫組織化學染色

采用SP法，主要步驟為:二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，3%雙氧水室溫處理10 min，PBS緩沖液洗滌，專用微波爐進行抗原修復，正常山羊血清37℃封閉、一抗4℃冰箱過夜，次日順序滴加二抗及三抗，DAB顯色10～15 min，蘇木精復染胞核，脫水透明并用中性樹膠封片。兔抗人FHIT多克隆抗體及SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。每次實驗均以Fhit蛋白在正常乳腺組織中表達作陽性對照。

1.3 結果判斷標準

對Fhit蛋白在組織中表達水平進行病理學觀察，以細胞質出現(xiàn)棕黃色染色為Fhit蛋白表達陽性，參考Gatalica［4］的 H-score(H=I× P)系統(tǒng)對實驗結果進行半定量判定:染色強度(I):依次為0分(無染色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)。染色范圍(P):以染色細胞數(shù)所占比例分為無陽性細胞或陽性細胞數(shù)≤10%記為0分，陽性細胞數(shù)為11% ～50%記為1分，陽性細胞數(shù)為51% ～75%記為2分，陽性細胞數(shù)＞75%記為3分。按下列公式計算Fhit蛋白陽性細胞百分率:Fhit蛋白表達細胞陽性率=陽性細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%(每張切片在200倍光學顯微鏡下按順序找5～10個視野，每個視野數(shù)100個細胞)。標準判定:0～3分為表達明顯減弱或陰性(-);4～6分為表達陽性(+);7～9分為表達強陽性(++)。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據輸入計算機并應用SAS6.12軟件進行分析。采用秩和檢驗、Spearman等級相關處理。檢驗水準α=0.05(雙側)，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FHIT在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中表達情況

Fhit蛋白主要分布于正常乳腺導管、腺泡上皮及癌細胞胞質中。在42例浸潤性導管癌中，有24例(57.1%)Fhit蛋白表達為陰性或明顯減弱，與良性對照組中Fhit蛋白表達陰性或明顯減弱(7/46)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0001)。在8例乳腺導管內癌組織中，F(xiàn)hit蛋白表達陰性或明顯減弱為4例(50.0%)，與良性對照組中Fhit蛋白表達陰性或明顯減弱(7/46)相比，差異也有顯著性(P=0.043)。在乳腺上皮增生發(fā)展為癌的過程中，F(xiàn)hit蛋白表達水平逐漸降低(P ＜0.01)，見表1。

表1 乳腺良、惡性組織中Fhit表達情況

2.2 乳腺浸潤性導管癌中Fhit蛋白的表達與臨床病理指標的關系

本組42例乳腺浸潤性導管癌標本中，F(xiàn)hit蛋白表達陽性率與年齡、腫塊大小、組織學分級無關，與淋巴結轉移情況及臨床分期有關，見表2。

Fhit與 ER、PR、Cerb-B2、p53 在乳腺浸潤性導管癌中表達的相互關系見表3，其中將Fhit表達(-)的試驗標本歸為Fhit陰性，F(xiàn)hit表達(+)和(++)的試驗標本歸為Fhit陽性。由表可知，42例患者中Fhit蛋白的表達與Cerb-B2的表達呈負相關，γs=-0.357(P＜0.05);Fhit蛋白的表達與p53的表達呈正相關，γs=0.411(P ＜0.01);與 ER、PR 的表達無明顯相關。

表2 42例乳腺浸潤性導管癌腫FHIT蛋白表達與臨床病理指標的關系

表3 Fhit與ER、PR、Cerb-B2、P53在乳腺浸潤性導管癌腫表達的相關性分析

3 討論

研究表明，在許多腫瘤組織中或腫瘤細胞株中，F(xiàn)HIT基因呈現(xiàn)多發(fā)性、廣泛性的純合性或雜合性缺失，提示此基因的異?？赡芎湍[瘤的發(fā)生有關，即為多種腫瘤的候選抑制基因［5］。本研究結果顯示Fhit蛋白主要分布于正常乳腺導管及腺泡上皮細胞胞質中，癌細胞亦見陽性細胞，在癌細胞浸潤的邊緣部分陽性細胞無明顯增加。乳腺病和乳腺導管上皮不典型增生組織中Fhit蛋白表達多為強陽性或陽性表達，乳腺導管內癌和乳腺浸潤性導管癌組織中Fhit蛋白表達多為明顯減弱或陰性。本研究中 Fhit蛋白在浸潤性導管癌中的陰性表達率(57%)高于導管內癌(50%)，且惡性組Fhit表達缺失明顯高于良性對照組(乳腺病、乳腺導管上皮不典型增生)中Fhit的表達缺失。在乳腺上皮增生發(fā)展為癌的過程中，F(xiàn)hit蛋白表達水平逐漸降低(P＜0.01)，提示FHIT缺失在乳腺癌的發(fā)病過程中起重要作用。Gatalica等［4］對乳腺癌進展不同階段的上皮(正常上皮、增生上皮、不典型增生及原位癌、浸潤性導管癌)進行Fhit蛋白表達的檢測時，發(fā)現(xiàn)Fhit蛋白表達的減少存在于增生性病變即乳腺癌發(fā)展的最早時期，而且Fhit蛋白表達的逐漸減少與病變進一步的發(fā)展有關系，具有明顯的負相關性，提示由于FHIT表達降低，其抑癌作用減弱，失去了對乳腺上皮增生并發(fā)展成癌的抑制作用，故FHIT表達減少與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關關系，對乳腺活檢組織進行 Fhit蛋白的檢測可能對乳腺癌的早期診斷及治療有重要意義。

本研究表明，F(xiàn)hit蛋白缺失與浸潤性導管癌的臨床分期、淋巴結轉移密切相關，說明 FHIT失活對乳腺癌的分子生物學行為有重要影響，可能是乳腺癌惡性度增高的標志，這一點與Mady等［6］的研究結果相一致。但對Fhit蛋白在乳腺癌中表達與臨床病理因素之間的關系進行分析時，各報道之間有一定的差異，所選取的樣本含量不同、不同種族、群體、遺傳背景及環(huán)境因素可能是造成這些差異的原因。趙坡等［7］對66例乳腺導管癌的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)hit蛋白低表達可能與癌組織浸潤及淋巴結轉移相關，但未能闡明其與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移數(shù)量、患者年齡、激素受體等的關系。Hayashi等［8］研究了61例乳腺癌的FHIT異常轉錄與臨床病理特征的關系，結果表明FHIT基因異常轉錄與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、雌、孕激素受體、局部轉移、乳腺癌家族史及患者的生活習慣 (吸煙、飲酒)等無關?？梢奆HIT表達與乳腺癌的臨床病理特征之間的關系還存在著不同的觀點，有待進一步深入研究。

總而言之，本研究結果提示FHIT基因表達產物Fhit蛋白表達水平降低在乳腺癌的發(fā)生和演化中發(fā)揮一定作用，對乳腺增生性疾病進行Fhit蛋白檢測，能在臨床及病理上對這些疾病的性質判斷提供幫助。Fhit蛋白低表達或表達缺失者可能具有較高的惡性行為和較差的預后。聯(lián)合檢測乳腺腫瘤組織中 FHIT、Cerb-B2、p53的表達，有助于對可疑癌進行早期診斷。

［1］Ohta M，Inoue H，Cotticelli MG，et al.The FHIT gene，spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8)break point，is abnormal in digestive tract cancers〔J〕.Cell，1996，84(4):587.

［2］Siprashrili Z，Sozzi G，Barnes LD，et al.Replacement of Fhit in cancer cells suppresses tumorigenicity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(25):13771.

［3］Beckmann MW，Niederacher D，Schnurch HG，et al.Multistep cancinogenesis of breast cancer and tumor heterogeneity〔J〕.J Mol Med，1997，75(6):429.

［4］Gatalica Z，Lele SM，Rampy BA，et al.The expression of Fhit protein is related Inversely to disease progression on inpatients with breast carcinoma〔J〕.Cancer，2000，88(6):1378.

［5］盧德成，羅佐杰，冼 晶.腎上腺皮質腫瘤增殖抗原和脆性組氨酸二聯(lián)體表達的相關性及意義〔J〕.中國綜合臨床，2008，24(8):753.

［6］Mady HH，Melhem MF.FHIT protein expression and its relation to apoptosis，tumor histologic grade and prognosis in colorectal adenocarcinoma:an immunohisto chemical and image analysis study〔J〕.Clin Exp Metastasis，2002，19(4):351.

［7］趙 坡，李曉瑛，陳樂真，等.乳腺癌中 FHIT蛋白的低表達與轉移的關系〔J〕.癌癥，2002，21(6):668.

［8］Hayashi S，Tanimoto K，Hajiro-nakanishi K，et al.Abnormal FHIT transcripts in human breast carcinomas:a clinicopathological and epidemiological analysis of 61 Japanese cases〔J〕.Cancer Res，1997，57(10):1981.