一特殊的可變性紅斑角化癥家系的研究

張曉嵐，陳洋，李久宏，李波，姜奕

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.皮膚科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

一特殊的可變性紅斑角化癥家系的研究

Study of a Specific Erythrokeratodermia Variabilis Family

張曉嵐1，陳洋2，李久宏1，李波1，姜奕2

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.皮膚科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

收集一個(gè)特殊的可變性紅斑角化癥的北方漢族家系血樣，從血樣中提取DNA，利用直接測(cè)序法測(cè)定其GJB3和GJB4序列。在本家系中未發(fā)現(xiàn)GJB3與GJB4的突變。

可變性紅斑角化癥；GJB3；GJB4

可變性紅斑角化癥（erythrokeratodermiavariabilis，EKV）是一種罕見的常染色體顯性遺傳病。E K V除具有特征性皮損外，還可伴掌跖角化［1］。國(guó)外對(duì)此病的突變基因的研究主要集中于GJB3及GJB4［2，3］。針對(duì)可變性紅斑角化癥的發(fā)病分別與兩個(gè)基因的第2外顯子區(qū)的基因突變有關(guān)，因此我們利用直接測(cè)序的方法對(duì)此中國(guó)家系進(jìn)行了GJB3與GJB4基因的第2外顯子區(qū)的基因檢測(cè)及篩選。現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2009年7月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚性病科門診收集1個(gè)特殊的可變性紅斑角化癥北方漢族家系。共有4代22人?，F(xiàn)有患者13人（男9人，女4人），正常親屬9人（男4人，女5人），家族系譜見圖1。其遺傳特點(diǎn)為：先證者的父親患此病，父輩家系中每代均有患者，呈連續(xù)傳遞，且每代中均有半數(shù)以上的人患有此病。其先證者，女，32歲，軀干四肢角化性紅斑31年?；颊邚?歲起軀干處無明顯誘因開始出現(xiàn)片狀角化性紅斑，漸于下肢伸側(cè)、上肢伸側(cè)出現(xiàn)同樣皮損。其界限清楚，表面粗糙（圖2）。皮損范圍與程度會(huì)隨溫度和心情的變化出現(xiàn)改變。自訴家系中其他患者表型相似，但程度有差異。30年來未曾治療。既往體健。

圖1 可變性紅斑角化癥家族系譜圖

圖2 先證者的腹部及雙膝部典型的紅斑角化型皮損

體格檢查：一般狀況良好，各系統(tǒng)檢查未見異常。專科查體：軀干、四肢伸側(cè)可見散在分布大小不等的紅色角化性斑塊，其上可見少量鱗屑，期間可見大小不等的正常皮島。邊緣清晰，形狀不規(guī)則。雙手雙足未見角化。實(shí)驗(yàn)室檢查：血、尿常規(guī)、肝腎功、血離子均正常。下肢伸側(cè)病理檢查示：鏡下見網(wǎng)籃狀的角質(zhì)層，未見明顯的角化不全，粒層略增厚，棘層略增厚，棘層內(nèi)無明顯水腫及炎性細(xì)胞外溢，上皮腳存在，基底層完整，真皮淺層血管周圍散在少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3）。結(jié)合臨床可診斷為：可變性紅斑角化癥。

圖3 可變性紅斑角化癥的病理結(jié)果 H E×40

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取外周血DNA：獲得知情同意后，收集該家系中先證者及其父親和弟弟的外周血2m l。加入2%EDTA抗凝，利用酚氯仿法提取DNA。用T E溶液-70℃保存。提取100例無親緣關(guān)系的健康個(gè)體基因組DNA作為對(duì)照。

1.2.2 GJB3與GJB4的擴(kuò)增和測(cè)序：網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索GJB3和GJB4的DNA序列。應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物為：GJB3F：5′GCCTGGTACATAGTAAATGC3′；GJB3R2：5′CTGAACAGGTAGGTCCACCA3′；GJB3F2：5′GCCGGCACCGCCAGAAACAC3′；GJB3R：5′CAGCCCCTGTAGGACCTCTCC3′；GJB4F：5′TCAATCGCACCAGCATTAAG3′；GJB4R：5′GGGGGACCTGTTGATCTTATC3′。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）：PCR反應(yīng)在PCR儀3100（AppliedBiosystems，美國(guó)）上進(jìn)行，反應(yīng)體系包括：10×反應(yīng)緩沖液5μl，MgCl23μl；dNTP4μl，TAP酶1μl，引物75ng，基因組DNA50ng，加去離子水至50μl。PCR條件：94℃預(yù)變性2min；94℃30s，60℃50s，72℃1min，36個(gè)循環(huán)；72℃7min。取2μlPCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。GJB3的目的片段分別為499bp和591bp，GJB4的目的片段為964bp?；厥漳康钠?，純化后用ABI3100自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序，用Chroma軟件包分析所得到的目的片段的測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

通過患者的臨床表現(xiàn)、病理結(jié)果及家譜分析確診為可變性紅斑角化癥，針對(duì)此家系DNA進(jìn)行GJB3和GJB4的外顯子全測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)有意義的突變。見圖4。

圖4 GJB3及GJB4的測(cè)序結(jié)果

表1國(guó)內(nèi)以往報(bào)告的可變性紅斑角化癥的病例特點(diǎn)總結(jié)編號(hào) 作者 報(bào)告年份 患者數(shù)皮損分布性 別 先證者男 女 發(fā)病年齡1 王麗英 2000 2 2 0 2個(gè)月 面部，小腿［6］2 趙天恩 2004 2 1 1 18歲 軀干、下肢、雙足［7］3 李常興 2005 1 1 0 18歲 左大腿伸側(cè)［8］4 楊寶琦 2006 1 1 0 5歲 軀干，四肢［9］5 孫文啟 2006 7 3 4 1個(gè)月 四肢，面部［10］6 任軍 2010 1 0 1 3歲 口周、腋下、腹股溝［11］

3 討論

紅斑角化癥是一組以廣泛分布的角化性紅斑為主要臨床特征并伴隨掌跖角化等表現(xiàn)的疾病。臨床上可分為進(jìn)行性對(duì)稱性紅斑角化癥和可變性紅斑角化癥2種類型［4］。其中，可變性紅斑角化癥是一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，由MendasdaCostas［5］于1925年首次報(bào)道。臨床表現(xiàn)主要有2種：（1）起于正常皮膚或在紅斑基礎(chǔ)上的散在、持久性紅棕色角化過度性斑片，常呈圖案形、逗點(diǎn)形、環(huán)形或多環(huán)形；（2）邊緣清晰的紅斑，散亂分布，大小、數(shù)量和位置變化迅速，可在數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)消退，部分持久不變，逐漸形成角化過度斑片。本例家系整個(gè)家族4代22人中發(fā)病13人，健康者9人。其中先證者分別在腹部、四肢處出現(xiàn)角化性紅斑，且發(fā)病會(huì)受到環(huán)境及情緒的影響。其他家庭成員中患者的表型相似，而程度不同。其病理檢查結(jié)果結(jié)合臨床特征符合可變性紅斑角化癥。近年來國(guó)內(nèi)針對(duì)可變性紅斑角化癥的病例報(bào)告共有5例，總結(jié)以往病例特點(diǎn)見表1。

GJB3與GJB4基因又名為縫隙連接蛋白基因。其中GJB3基因定位于1p 33-1p 35，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，全長(zhǎng)5178b p，GJB4基因定位于1p 34-1p 35，具有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)3984b p。目前國(guó)外研究認(rèn)為，E K V的發(fā)病與GJB3和GJB4的基因突變有關(guān)，該病患者GJB3及GJB4基因分別有8個(gè)和6個(gè)突變位點(diǎn)［12，13］。在亞洲人群中GJB3的第357位點(diǎn)處C T點(diǎn)突變占患病者的1/8，GJB3的94位點(diǎn)處C T點(diǎn)突變占發(fā)病人群的1/80，但是前者為無意義突變［14］。崔勇等［15］于2004年曾進(jìn)行了進(jìn)行對(duì)稱性紅斑角化癥的基因?qū)W研究，針對(duì)L O R、GJB3和GJB4的基因進(jìn)行測(cè)序，均未發(fā)現(xiàn)突變。2008年Akman［16］報(bào)道了1例土耳其的進(jìn)行性對(duì)稱性紅斑角化癥的家系，也未在GJB3和GJB4基因中發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。本研究是國(guó)內(nèi)首次針對(duì)1個(gè)可變性紅斑角化癥的北方漢族家系的DNA，運(yùn)用直接測(cè)序法進(jìn)行GJB3和GJB4基因全外顯子測(cè)序，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)有意義的突變，與國(guó)外針對(duì)E K V的基因突變研究的結(jié)果不同。本研究于國(guó)內(nèi)首次提出了E K V具有遺傳異質(zhì)性，我們認(rèn)為針對(duì)不同的種族可能有不同的突變基因。

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（編輯王又冬，英文編輯王又冬）

R758.61

A

0258-4646（2011）02-0184-02

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0956.025

張曉嵐（1984-），女，碩士研究生.

姜奕，E-mail：yjiang58@hotmail.com

2010-09-17