反相高效液相色譜法測(cè)定不同品種花椒中蘆丁和槲皮素的含量

吳亮亮,石雪萍,張衛(wèi)明

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 210042;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

花椒 (Zan thoxylum bungeanum)屬蕓香科,全世界約有 250種,分布于亞洲、美洲、非洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國約有 45種,13個(gè)變種,主要品種為青椒 (Z.sch inifolium Sieb.et Zucc.)和花椒 (Z.bungeanum Maxim.)[1]?；ń分泻刑J丁、槲皮素等數(shù)十種黃酮類成分[2]。黃酮具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種療效[3]。蘆丁又名蕓香苷、紫槲皮苷,是槲皮素的 3-O-蕓香糖苷,為一來源很廣的黃酮類化合物,廣泛存在蕓香科植物中。蘆丁和槲皮素是其主要活性成分,具有廣泛的藥理活性,開發(fā)前景廣闊。黃酮的分析方法,已報(bào)道有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等[4-6]。目前中藥材中黃酮的的主要測(cè)定方法主要是高效液相色譜法[7-9],為了綜合開發(fā)花椒這種植物資源,掌握不同地區(qū)花椒中蘆丁和槲皮素的含量,本實(shí)驗(yàn)首次建立了 RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定花椒中蘆丁和槲皮素含量的測(cè)定方法,并首次考察了不同產(chǎn)地的紅花椒與青花椒上述 2種黃酮類成分的量,為花椒黃酮的后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器 (DAD)、安捷倫化學(xué)工作站、Zorbax保護(hù)住(H4033A)(安捷倫科技有限公司);JA 3103N分析天平 (上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司)。T6新世紀(jì)紫外 -可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限公司)

樣品:蘆丁對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品,均由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇、磷酸為 HPLC級(jí),水為純凈水。其它試劑為分析純。

花椒樣品分別為韓城紅花椒、四川青花椒、云南青花椒、茂漢紅花椒,購于原料產(chǎn)地。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Zorbax Eclipse C18色譜柱 (150 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇 -0.4%磷酸 (50∶50);流速:1 mL/m in;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;柱溫 25℃;進(jìn)樣量 5μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取 120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各 50 m g,加20 mL 80%甲醇溶解,并繼續(xù)用甲醇轉(zhuǎn)移至 50 mL容量瓶中,定容至刻度,配成蘆丁和槲皮素濃度均為1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。將此母液分別稀釋1/2 、1/4、1/10、1/20倍 ,得 5個(gè)濃度梯度的對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液制備 將樣品 60℃干燥,粉碎過 40目篩,精密稱取樣品粉末 2.0 g,精確加入 60%乙醇40 mL,超聲波輔助提取 30 min,提取液濾過置 50 mL量瓶中,加乙醇定容至刻度。用 0.45μm的微孔濾膜濾過,即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取 2.2節(jié)的混合對(duì)照品溶液 5μL進(jìn)樣,以色譜峰面積 (Y)對(duì)進(jìn)樣量 (X)進(jìn)行回歸,計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 蘆丁和槲皮素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表1的結(jié)果表明蘆丁和槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取 2.2節(jié)的混合對(duì)照品母液 5μL,在上述色譜條件下,重復(fù)進(jìn)樣 5次,分別計(jì)算蘆丁、槲皮素的峰面積 RSD值,蘆丁 RSD為 0.61%、槲皮素 RSD為 1.32%,表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取茂漢紅花椒果皮粉末

5份,每份 0.5 g,照供試品溶液制備方法進(jìn)行提取處理后,精密吸取 5μL在上述色譜條件下進(jìn)行分析,計(jì)算峰面積的 RSD值,蘆丁 RSD為 3.15%、槲皮素 RSD為 2.50%,結(jié)果表明使用該法處理樣品的重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試樣品 ,分別在 0、2、4、6、8 h測(cè)定蘆丁、槲皮素的峰面積,結(jié)果表明蘆丁、槲皮素在 8h內(nèi)穩(wěn)定性良好,RSD分別為 1.02%,2.13%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取樣品液 200μL,3份。分別精密加入 2.2節(jié)的混合對(duì)照品母液 30、40、50μL混合,精密吸取 5μL。在上述色譜條件下進(jìn)行分析,結(jié)果蘆丁平均回收率 99.1%,RSD為4.3%。槲皮素平均回收率 111.2%,RSD為 5.1%。

2.9 不同花椒品種樣品測(cè)定 取不同品種花椒各2 g,按供試品溶液制備項(xiàng)下處理,在上述色譜條件下進(jìn)行分析,結(jié)果圖1和表2。

圖1 對(duì)照品 (A)和韓城花椒提取物 (B)色譜圖

表2 不同花椒品種中蘆丁、槲皮素含量測(cè)定

3 討 論

3.1 花椒黃酮提取方法的確定 通過對(duì)冷浸提取、加熱回流提取及超聲波輔助提取的比較,確定用超聲波輔助提取 30 m in效果較好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將蘆丁和槲皮素對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,在 254 nm和360 nm處有兩個(gè)吸收峰,鑒于低波長(zhǎng)處雜質(zhì)的干擾,本實(shí)驗(yàn)選用 360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)先后選擇了甲醇∶水(50∶50)及甲醇:0.4%磷酸水溶液,并且調(diào)節(jié)等體系作為流動(dòng)相進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。試驗(yàn)表明不加磷酸的流動(dòng)相對(duì)于樣品中黃酮和雜質(zhì)的分離度不夠,不能有效的分離開來,且拖尾嚴(yán)重,加入磷酸可有效防止。且甲醇濃度過高,出峰時(shí)間短,分離度不好,甲醇濃度過低比例在 50∶50最合適。保證蘆丁和槲皮素在 10 m in之內(nèi)出峰,且和雜質(zhì)峰有效分離。

3.4 對(duì)不同產(chǎn)花椒中蘆丁和槲皮素含量的比較

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,反相高效液相色潽法測(cè)定花椒中蘆丁和槲皮素的含量,方法穩(wěn)定、可行?；ń分刑J丁含量較高,韓城紅花椒 >茂漢紅花椒 >四川青花椒 >云南青花椒。槲皮素在韓城紅花椒中含量明顯高于其他三種花椒。綜合考慮,紅花椒比青花椒更適合花椒黃酮類成分研究。

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