八角葉總黃酮的提取及其捕獲自由基作用研究

莫麗玲,肖詞英,黃鎖義,黃世穩(wěn),黃麗秀,馬連榮

(1.右江民族醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院,廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學院藥學系,廣西百色 533000)

八角茴香 (Illicium verum Hook.f.),又稱大茴香、八角、八月珠,是木蘭科八角屬植物,是我國南方重要的“藥食同源”的經(jīng)濟樹種,主要分布在我國的廣西、廣東、云南等省。其干燥成熟果實含有芳香油約 5%～8%,脂肪油約 22%以及蛋白質(zhì)、樹脂等,為我國的特產(chǎn)香辛料和中藥,也是居家必備的調(diào)料,在食品加工業(yè)及香料工業(yè)廣泛應用;同時八角具有健胃止咳的功效,醫(yī)藥上用于治療神經(jīng)衰弱、消化不良、疥癬等癥,八角是抗流感特效藥“特敏?！钡闹饕蟍1]、是有效對付致命的 H 5N1禽流感病毒的藥物“達菲”的重要成分[2]。我國目前消費的八角作香料和藥物使用,研究表明[3-5]:八角茴香的化學成分主要有揮發(fā)性化合物、倍半萜內(nèi)酯及其衍生物、黃酮類成分 (如八角茴香果實中含有 3-蕓香糖,3-葡萄糖,3-半乳糖取代的山萘酚和槲皮素,3-鼠李糖槲皮素,3-木糖槲皮素以及游離的山萘酚和槲皮素等)、苯丙烷和木脂素類、糖脂,磷脂 (包括卵磷脂、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇),β-谷甾醇,菜油甾醇和維生素 E,胡蘿卜苷和莽草酸。紅花八角莖、葉中還含三十烷醇 -1,莽草酸和槲皮素 -3-O-鼠李糖苷。八角種子還含油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸等脂肪酸。八角茴香的藥理作用有[3,6]:抑菌作用、升高白細胞作用、鎮(zhèn)痛作用、其它作用:茴香醚具雌激素樣作用和較強的致敏作用。

黃酮類成分有明顯的抗?jié)儭⒔獐d、抗菌、抗炎、降血脂、鎮(zhèn)痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用[7]。目前,對八角的研究多是芳香油、茴香油樹脂的提取和應用[3]。近年來,超聲技術(shù)應用于提取植物中的生物堿、黃酮、苷類、生物活性物質(zhì)、動物組織漿的毒質(zhì)等研究已有報道[8],表明其具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點。但超聲技術(shù)應用于提取八角植物黃酮及其鑒別的研究未見報道,為此,本文應用超聲技術(shù)提取八角植物葉總黃酮及其對羥自由基清除作用研究,現(xiàn)報道如下。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

材料:新鮮八角葉 (采自廣西南寧、賀州、河池、欽州、百色)。

試劑:95%乙醇;亞硝酸鈉 AR;硝酸鋁 AR;氫氧化鈉 AR;三氯化鋁 AR;鹽酸 AR;氨水 AR;乙酸鎂 AR;鎂粉 AR;正丁醇 AR;冰醋酸 AR;乙酸乙酯AR;蘆丁標準品 (中國藥品生物制品檢定所)

儀器:KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 (超聲工作頻率 40KHz,昆山市超聲儀器有限公司);UV-755B紫外可見分光光度計 (上海分析儀器總廠);ZF-I型三用紫外分析儀 (上海顧村光電儀器廠);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 測定條件的選擇

1.2.1 波長的選擇

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,分別以 60%乙醇、石油醚、蒸餾水為溶劑,分別以溫度為 80℃,功率為 100 W,超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣分別再加相應溶劑,超聲波提取 2.0 h,抽濾,各分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液,取任意產(chǎn)地的黃酮粗提液適量,在 0.30 m L 5%亞硝酸鈉溶液存在的堿性條件下,經(jīng)硝酸鋁顯色后,以試劑為空白液在 420～700 nm波長范圍測定絡(luò)合物的吸光度,絡(luò)合物于 510 nm波長處有最大吸收,故測定時選用此波長。

1.2.2 標準曲線的制備

精密吸取蘆丁對照品標準溶液 (每 1 mL含有無水蘆丁 0.2 m g)0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0 mL分置再加 10%硝酸鋁溶液 2.0 mL,混勻,放置6 m in,加 5%氫氧化鈉溶液 20 m L,最后用 60%乙醇于 50 mL容量瓶中,各加 60%乙醇 12mL,加 5%亞硝酸鈉溶液 2.0 mL,混勻,放置 6 m in,稀釋至刻度,搖勻,以第 1瓶為空白溶液,用 UV-755B紫外可見分光光度計,在 510 nm波長處測定吸光度,建立回歸方程,結(jié)果見表1。

表1 紫外可見分光光度計測定蘆丁對照液吸光度

根據(jù)上表得回歸方程:A=4.054 1×10-4+

1.413 6C,r=0.999 0。

1.2.3 超聲波與非超聲波提取的對比實驗

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,分別以 60%乙醇、石油醚、蒸餾水為溶劑,分別以溫度為 80℃,功率為 100 W,超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣分別再加相應溶劑,超聲波提取 2.0 h,抽濾,各分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液,分別取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度 (非超聲波法:在 1.2.3節(jié)方法中,把超聲波提取 2.0 h改為在 80℃下分別以 60%乙醇、石油醚、蒸餾水為溶劑回流提取 2.0 h,其余方法一樣)。結(jié)果見表2。

表2 超聲波與非超聲波提取液的吸光度

由表2對比可知,采用以 60%乙醇為溶劑的超聲波法提取黃酮的吸光度最大,提取效率最高。故超聲波法提取總黃酮宜用乙醇為提取溶劑。

1.2.4 不同溫度對超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以 60%乙醇為溶劑,功率為 100 W,以不同溫度超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣加 60%乙醇,超聲波提取 2.0 h,抽濾,合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表3。

表3 不同溫度超聲波提取液的吸光度

由表2可知,溫度為 80℃提取黃酮的吸光度較大,提取效率較高,故超聲波法提取總黃酮宜在 80℃進行。

1.2.5 不同濃度乙醇對超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以不同濃度乙醇為溶劑,功率為 100 W,以溫度80℃超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣加相應乙醇,超聲波提取 2.0 h,抽濾,合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表4。

表4 不同濃度乙醇超聲波提取液吸光度

由表4可知,乙醇濃度為 90%提取黃酮的吸光度較大,提取效率較高,故超聲波法提取總黃酮宜用90%乙醇為提取溶劑。

1.2.6 不同功率對超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以不同濃度乙醇為溶劑,溫度為 80℃,不同超聲功率條件下提取 2.0 h,抽濾。濾渣加相應乙醇,超聲波提取,抽濾,合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表5。

表5 不同超聲功率提取液吸光度

由表5可知,超聲功率為 60 W時總黃酮吸光度最大,提取效率最高,故超聲波法提取總黃酮宜用60 W超聲功率。

1.2.7 不同時間對超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以 90%乙醇為溶劑,溫度為 80℃,功率為 60 W,在不同時間的條件下提取,抽濾。濾渣加 90%乙醇,超聲波提取相應的時間,抽濾,分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表6。

表6 不同時間超聲波提取液吸光度

由表6可知,提取黃酮時間為 3.0 h時總黃酮吸光度較大,提取效率較高,故超聲波法提取總黃酮的提取時間為 3.0 h。

最后確定提取總黃酮的最佳工藝條件為:溶劑為 90%乙醇,溫度為 80℃,超聲波功率為 60 W,提取時間為 3.0 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地八角葉總黃酮含量的測定

取不同產(chǎn)地新鮮八角葉,烘干,粉碎。分別稱取八角葉的粉末 5 g,以 90%乙醇為溶劑,溫度為 80℃,功率為 60 W,提取 3.0 h,抽濾。濾渣加 90%乙醇,超聲波提取相應的時間,抽濾,分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表7。

表7 不同產(chǎn)地總黃酮含量

2.2 回收實驗

精密量取樣品提取液 2.0 mL,加入 2.0 mL蘆丁對照品,同 2.1節(jié)方法測定吸光度,求出回收率為97.25%。

2.3 鑒別實驗

2.3.1 顏色反應[9]

取八角黃酮提取液進行顏色反應,結(jié)果為:紫外光下呈色反應有灰褐色并有熒光斑點;濃氨水反應紫外光下有極明顯的黃褐色熒光斑點;三氯化鋁反應紫外光下有黃色熒光斑點;乙酸鎂反應紫外光下有黃色斑點;鹽酸 -鎂粉反應有紫紅色。

2.3.2 紙層析[9]

用正丁醇 ∶醋酸 ∶水 =4∶1∶5(體積比 )為展開劑 ,取樣品溶液進行紙層析,在紫外光下呈熒光斑點。

2.4 藥理實驗[10]

參照 Fenton反應的方法建立反應體系模型[11],通過 H2O2與 Fe2+混合產(chǎn)生·OH,但由于·OH具有很高的反應活性,存活時間短,若在反應體系中加入水楊酸,就能有效地捕捉·OH,并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。根據(jù)固定反應時間法,在相同體積的反應體系 (8.8 mmo l/L H2O21 m L,9 mmo l/L Fe2+1 m L,9 mmo l/L 1 mL水楊酸 -乙醇溶液)加入一系列不同濃度的總黃酮提取液,在 510 nm處分別測其對·OH的清除作用,結(jié)果見表8。

其清除率計算公式:

結(jié)果表明,八角葉總黃酮提取液對由 Fenton體系產(chǎn)生的·OH有很好的清除作用,清除率隨著黃酮類物質(zhì)濃度的增大而增大。

表8 不同濃度的總黃酮提取液對·OH的清除率

3 結(jié) 論

超聲波提取八角葉總黃酮的最佳工藝條件是:

溶劑 90%乙醇,溫度 80℃,超聲波功率 60 W,提取時間 3.0 h,超聲波提取效率遠高于傳統(tǒng)的乙醇浸提法,河池產(chǎn)八角葉總黃酮含量最高,其次是欽州和百色,提取物總黃酮對羥自由基有很好的清除作用,為八角的藥效學、藥代動力學、分子藥理學和制劑學等方面進行進一步的研究工作提供了參考依據(jù)。

(注:本文榮獲 2009年廣西高校化學化工類論文及設(shè)計競賽三等獎)

[1] 法新社.中草藥風行全球,大錢被日韓賺了 [N].參考消息,2005-10-29(8).

[2] 法新社.八角茴香:對付禽流感的利器[N].參考消息,2005-11-02(7).

[3] 王 琴,蔣林,溫其標,等.八角茴香的研究進展 [J].中國調(diào)味品,2005(5):18-22.

[4] Kouno I,Yang C S, Iwamoto C,et al.Anewtriphenyl--type neolignan and a biphenylneolignan from the barks of Illiciuum simon sii[J].Chem Pharm Bull,1994,42(1):112.

[5] KounoI,Yang C S,Hashimoto M,et al.Isolation of neoanisatin rivatives from the pericarps of Illiciummajus with other constituents[J].Chem Pharm Bull,1991,39(7):1773.

[6] KounoI,Yang C S,Morisaki T,et al.Two new Sesquineolignans from the bark of Illicium dunnianum[J].Chem Pharm Bull,1991,39(10):2606.

[7] 李洪玉,孫靜蕓,戴詩文.竹葉黃酮提取物的生產(chǎn)工藝條件研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2004,21(5):371-372.

[8] 黃鎖義,黎海妮,唐玉蓮,等.超聲波提取芒果葉總黃酮[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2006,23(6):455-456.

[9] 鄒勇芳,黃鎖義,李衛(wèi)彬,等.肉桂植物總黃酮的超聲波提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2008,29(4):20-23.

[10] 黃鎖義,羅建華,張麗丹,等.茉莉花莖總黃酮提取及對羥自由基清除作用[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(3):592-593.

[11] 李貴榮,楊勝圓.黨參多糖的提取及其對活性氧自由基的清除作用[J].化學世界,2001,42(8):21-22.