氨基胍對人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖影響的體外試驗研究

林 智

（海口市瓊山區(qū)人民醫(yī)院眼科，海口市 571100）

氨基胍對人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖影響的體外試驗研究

林 智＊

（?？谑协偵絽^(qū)人民醫(yī)院眼科，?？谑?571100）

目的：觀察氨基胍（AG）對體外培養(yǎng)的人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖的影響。方法：取人翼狀胬肉標(biāo)本進(jìn)行體外貼壁細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，傳代至第3～5代細(xì)胞用于試驗，以每孔1×104個細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，加入不同濃度（250、500、750、1000μmol·L－1）的AG作為AG組，另設(shè)不加AG的為對照組，檢測作用24、48、72h后各孔的吸光度，并計算細(xì)胞增殖抑制率，每個時間點(diǎn)、每個濃度均設(shè)6個復(fù)孔。結(jié)果：人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖抑制率隨AG濃度的增大和作用時間的延長明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：AG在受試濃度和受試時間范圍內(nèi)，對體外培養(yǎng)的人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞具有抑制作用且呈濃度、時間依賴性。

人翼狀胬肉；成纖維細(xì)胞；氨基胍；細(xì)胞增殖抑制率；體外試驗

翼狀胬肉是局部球結(jié)膜纖維血管組織增生侵犯角膜的一種疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確[1]。病理學(xué)研究表明，翼狀胬肉的主要成分是異常增生的成纖維細(xì)胞，并因其導(dǎo)致的相應(yīng)病變，此基本病變與多種纖維增生性疾病有相似之處[2]。近年研究[3]表明，氨基胍（AG）作為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑，對體外培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞有抑制作用。本試驗通過在體外培養(yǎng)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞（HPF），觀察AG對HPF增殖的影響，為探討翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HERAcell 150型CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；Sunrise型酶標(biāo)儀（奧地利Sunrise公司）；Ⅸ71型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

AG（美國Sigma公司，批號：396494，超級純）；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）（美國Amresco公司，超級純）；二甲基亞砜（DMSO，研域（上海）化學(xué)試劑有限公司，批號：0603174，優(yōu)級純）；小牛血清（特優(yōu)級）、RPMI 1640培養(yǎng)基（超級純）（美國Gibco公司）。

1.3 組織標(biāo)本

20例原發(fā)性翼狀胬肉患者，于我科門診行翼狀胬肉切除術(shù)，男12例，女8例，年齡32～54歲。人翼狀胬肉組織標(biāo)本取材均為鼻側(cè)臉裂部近角鞏膜緣球結(jié)膜組織。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人翼狀胬肉組織標(biāo)本，在超凈工作臺上剪成約1.0mm3的組織塊，均勻接種于培養(yǎng)瓶底，待組織塊貼壁后加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，2～3d換液1次，待細(xì)胞覆蓋瓶底80%后用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。傳代時采用差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞的分離和純化，SABC（Strept avidin-biotin complex）免疫組化染色法進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白染色，確認(rèn)為成纖維細(xì)胞后，取第3～5代細(xì)胞用于試驗[4]。

2.2 成纖維細(xì)胞增殖抑制率檢測

HPF細(xì)胞傳代至第3～5代，將處于對數(shù)生長期的HPF細(xì)胞，以每孔1×104個的濃度接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔加液200μL，再加入不同濃度（250、500、750、1000μmol·L－1）的AG作為AG組，另設(shè)不加AG的作為對照組，分別于作用24、48、72h時每孔加入濃度5g·L－1MTT 20μL－1，培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩溶解10min，待結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀上，490nm波長處，測定各孔吸光度（A），并計算細(xì)胞增殖抑制率，每個時間點(diǎn)、每個濃度均設(shè)6個復(fù)孔。細(xì)胞增殖抑制率＝（1－AG組A值/對照組A值）×100%[5]。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用兩樣本t檢驗，P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果

結(jié)果表明，AG對體外培養(yǎng)的HPF增殖具有抑制作用，在0～1000μmol·L－1濃度范圍及24～72h時間范圍內(nèi)，呈劑量、時間依賴性，且具有顯著性差異，具體詳見表1。

表1 不同濃度AG作用不同時間對HPF增殖的影響Tab1 Inhibition rate of human pterygium fibroblast proliferation by different concentrations of AG after different period

4 討論

翼狀胬肉是一種組織增生性疾病，其細(xì)胞異常增殖和凋亡，與腫瘤細(xì)胞有相似之處。其形成、發(fā)展和術(shù)后復(fù)發(fā)都需要新生血管化的參與。顏美榮等[6]研究證實，iNOS在翼狀胬肉中表達(dá)增強(qiáng)，與翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。本研究選擇iNOS抑制劑AG[7]，觀察不同濃度的AG對HPF增殖的影響。結(jié)果表明，AG對HPF增殖有明顯的抑制作用，分析原因可能是：（1）翼狀胬肉并非腫瘤，但具有腫瘤類似的特點(diǎn)，細(xì)胞能異常增殖和凋亡；（2）翼狀胬肉向角膜發(fā)展侵襲的必備條件是新生血管的形成；（3）AG抑制了iNOS，從而抑制了新生血管壁成纖維細(xì)胞的增生。

[1] 趙春明，張明昌，晏雪瑩，等.β-NGF對人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增生的影響[J].眼科研究，2009，27（11）：955.

[2] 莫百軍，王映芬，蔡康榮，等.蝮蛇抗栓酶對人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖效果的影響[J].眼視光學(xué)雜志，2005，7（1）：30.

[3] 孫玉敏，張麗萍.AG對大鼠纖維化肺成纖維細(xì)胞表達(dá)CTGF的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38（5）：541.

[4] 羅 艷，黃艷明，劉恒明.轉(zhuǎn)化生長因子β2抗體對體外培養(yǎng)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，27（10）：1176.

[5] 蔣 麗，張明昌.NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸對人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖的影響[J].國際眼科雜志，2007，7（1）：86.

[6] 顏美榮，李正賢，劉庚勛，等.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在翼狀胬肉中的表達(dá)及其意義[J].臨床軍醫(yī)雜志，2007，35（2）：183.

[7] 李強(qiáng)翔，李 瑋，謝小英，等.氨基胍和維生素C對糖尿病腎病模型大鼠血清層粘連蛋白的影響[J].中國藥房，2005，16（23）：1776.

Effect of Aminoguanidine on the Proliferation of Human Pterygium Fibroblast in Vitro

LIN Zhi
（Dept.of Ophthalmology，Haikou Qiongshan District People’s Hospital，Haikou 571100，China）

OBJECTIVE：To observe the effect of aminoguanidine（AG）on the proliferation of in vitro cultured human pterygium fibroblast.METHODS：Human pterygium specimens were obtained to conduct normal in vitro-culture of adherent cells and use the 3～5generation cells for experiment.1×104cells were inoculated in each well of culture plate supplemented with different concentrations of AG（250，500，750，1000μmol·L－1）as AG group.Other culture plate weren’t supplemented with AG as control group.The absorbency of each well were detected on 24，48，72h.The inhibition rate of cell growth was detected.6reduplicate wells of each time point and each concentration were established.RESULTS：With the concentration of AG increasing and acting time delay，the inhibition rate of human pterygium fibroblast growth increased significantly（P＜0.05）.CONCLUSION：In a certain range of concentration and time，AG have inhibited the proliferation of in vitro cultured human pterygium fibroblast in concentration and time-dependent manner.

Human pterygium；Fibroblasts；Aminoguanidine；Inhibition rate of cell growth；In vitro test

＊主治醫(yī)師。研究方向：白內(nèi)障、青光眼及眼表疾病。電話：0898-36651367。E-mail：454021106@qq.com

R777.33；R969

A

1001-0408（2011）17-1558-02

2010-11-17

2011-01-10）