結(jié)核分枝桿菌RpfA蛋白的表達(dá)、純化與鑒定＊

趙善民,江 鷹,趙 勇,毛峰峰,張彩勤,郭曉雅,白 冰,師長宏

Rpf(resuscitation promoting-factor)蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的與休眠細(xì)菌復(fù)蘇相關(guān)的促生長因子[1],該蛋白首先在藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中發(fā)現(xiàn)[2];進(jìn)一步研究證實(shí),該因子也可刺激其他種類的高G+C含量的革蘭陽性菌,包括結(jié)核分枝桿菌[3]。結(jié)核分枝桿菌的 Rv0867c、Rv1009c、Rv1884c、Rv2389c和Rv2450c均能編碼 Rpf樣蛋白,這5種Rpf蛋白均被證實(shí)有可能作為結(jié)核病防治的靶抗原加以應(yīng)用[4]。Rv0867c所編碼的RpfA蛋白不僅與細(xì)菌的增殖有關(guān),還有可能是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的一個(gè)靶抗原[5]。為此,本研究通過PCR方法從結(jié)核分枝桿菌 H37Rv中獲得 Rv0867c的基因片段,進(jìn)而構(gòu)建pET32a(+)-Rv0867c重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,表達(dá) His-Rv0867c融合蛋白,為結(jié)核桿菌疫苗和快速診斷的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌E.coliBL21由本中心保存,克隆載體pMD18-T質(zhì)粒購自大連 Takara公司,表達(dá)載體pET32a(+)質(zhì)粒購自 Invintrogen公司。

1.2 試劑 T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶B amH I和HindⅢ均購自大連 Takara公司,質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自BBI公司,膠回收試劑盒購自北京鼎國公司,含Ni2+螯合劑的Ni-NTA His純化試劑盒購自Invintrogen公司,HRP-羊抗鼠 IgG購自武漢博士德公司,小鼠Anti-His Tag mAb購自上海生工,抗Rpf domain mAb由西京醫(yī)院檢驗(yàn)科樊愛琳博士饋贈(zèng)[6],臨床 TB病人血清由第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科提供。

1.3 目的基因的獲得 根據(jù) GenBank中結(jié)核分枝桿菌Rv0867c的全基因序列,長度為1 224 bp。設(shè)計(jì)引物,其序列為p1:5′-ATGGATCCATGAGTGGACGCCACCGTAAG-3′,p2:5′-TAAAGCTTT CAGCCGTGACGTACGG-3′,分別插入B amH Ⅰ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)。PCR總體系為:50μL體系,反應(yīng)條件:95℃5 min預(yù)變性后,95℃1 min,59℃1 min,72℃1 min,30個(gè)循環(huán)后,72℃再延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果。

1.4 克隆載體的獲得 用 T4連接酶將 PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliBL21。隨機(jī)挑取3個(gè)菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中。經(jīng)B amH Ⅰ和HindⅢ雙酶切鑒定后,將篩選出的陽性克隆送北京奧科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 含目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 提取測序正確的重組克隆質(zhì)粒,經(jīng)B amHⅠ和HindⅢ雙酶切后,回收目的基因條帶。將Rv0867c片段與同樣酶切的表達(dá)載體pET32a(+)連接,轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞,涂在含氨芐青霉素的LB平板上。37℃溫箱培養(yǎng)過夜,次日從平板上隨機(jī)挑選3個(gè)透明直徑約1 mm的單個(gè)菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃過夜培養(yǎng)活化,提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,陽性克隆即為pET32a(+)-Rv0867c。

1.6 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組表達(dá)載體的陽性克隆再活化后以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到5 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)2～3 h,加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h,離心回收菌體沉淀,以2×凝膠加樣緩沖液50μL懸浮,煮沸5～10 min,離心后取10μL上清進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,觀察目的蛋白的表達(dá)。

1.7 目的蛋白的Western-blot測定 上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行10%SDS-PA GE后,100 V恒壓電轉(zhuǎn)1 h,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后用麗春紅染色,觀察蛋白電轉(zhuǎn)是否成功,然后用蒸餾水洗至無色,l0 g/L牛血清白蛋白封閉過夜,TBST清洗3次,分別與小鼠Anti-His Tag單克隆抗體、1∶10稀釋的抗 Rpf domain mAb和1∶10稀釋的 TB病人血清結(jié)合1 h,TBST洗滌三遍后,再分別與 HRP-羊抗鼠 IgG抗體結(jié)合1 h,TBST搖床震蕩洗滌3次,TBS震蕩洗滌3次,化學(xué)發(fā)光顯色。

1.8 目的蛋白的可溶性分析及純化 按前述方法誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)并收集菌體,加入去離子水重懸菌體,超聲裂菌,12 000 r/min離心,將上清、沉淀分別制樣,通過SDS-PAGE進(jìn)行可溶性分析。根據(jù)可溶性分析的結(jié)果,以相應(yīng)的方式用鎳離子柱親和層析純化融合蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增、克隆及酶切鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示Rv0867c基因的PCR產(chǎn)物大小在1 224 bp左右,與Rv0867c的基因預(yù)期大小相符。重組質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳檢測到大小為1 224 bp的片段,證明pET32a(+)-Rv0867c構(gòu)建成功。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的Rv0867c基因一致,見圖1。

圖1 Rv0867c基因的酶切鑒定圖1:DNA marker DL2000;2:Rv0867c PCR基因片段;3:BamH Ⅰ與 HindⅢ雙酶切pMD18-T-Rv0867c片段;4:BamH Ⅰ與 HindⅢ雙酶pET32a(+)-Rv0867c片段Fig.1 Identification of recombinant plasmid1:DNA marker DL2000;2:Rv0867c gene fragment;3:pMD18-T-Rv0867c digested byBamH I andHindIII;4:pET32a(+)-Rv0867c digested by BamH I andHindIII

2.2 重組質(zhì)粒的測序鑒定 將質(zhì)粒pMD18-TRv0867c樣品送上海生物工程公司測序,雙向測序結(jié)果顯示與 GenBank上公布的 RpfA編碼序列完全一致。

2.3 目的蛋白的表達(dá) 重組菌誘導(dǎo)前后表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE顯示,誘導(dǎo)的重組菌在約102 kDa處有一蛋白條帶,同預(yù)計(jì)的大小相吻合,而未誘導(dǎo)菌無此條帶,見圖2。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析1:蛋白 marker;2:BL21中未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET32a(+)-Rv0867c的表達(dá)產(chǎn)物;3-5:BL21中誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET32a(+)-Rv0867c的表達(dá)產(chǎn)物Fig.2 SDS-PAGEanalysis of expression product1:Protein marker;2:Expression product of pET32a(+)-Rv0867c without induction in BL21;3-5:Expression product of induced pET32a(+)-Rv0867c in BL21

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定 結(jié)果顯示,在相對(duì)分子量約為102 kDa處各有一條表達(dá)帶,表明表達(dá)產(chǎn)物分別可與Anti-His Tag單抗、Rpf結(jié)構(gòu)域單抗和 TB病人血清特異性結(jié)合,見圖3。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定1,3,5:表達(dá)產(chǎn)物與空BL21菌陰性對(duì)照;2:表達(dá)產(chǎn)物與小鼠Anti-His Tag mAb的結(jié)合帶;4:表達(dá)產(chǎn)物與抗Rpf domain mAb的結(jié)合帶;6:表達(dá)產(chǎn)物與 TB病人血清的結(jié)合帶Fig.3 The results of Western-blot analysis1,3,5:Negative control of empty BL21;2:Banding of expression product and mouse against Anti-His Tag mAb;4:Banding of expression product and Anti-Rpf domain mAb;6:Banding of expression product and sera of TB patient

2.5 表達(dá)蛋白的可溶性檢測及親和層析純化 在重組菌液中加入尿素裂解液,用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲裂解后,離心,分別取上清和沉淀進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,結(jié)果顯示表達(dá)的融合蛋白主要以不可溶狀態(tài)(包涵體)存在,見圖4。從重組菌中制備的包涵體經(jīng)洗滌后,用8 mol/L尿素變性,經(jīng)超聲裂解后加樣到Ni-NTA金屬鰲合親和層析柱上,由于質(zhì)粒pET32a(+)多克隆酶切位點(diǎn)上游插入編碼6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的序列(6×His Tag),在重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí),6×His Tag與外源插入片段共同表達(dá),因而融合蛋白帶有6×His Tag,后者可與金屬鎳發(fā)生鰲合,從而使目的蛋白在流經(jīng)柱床時(shí)被特異性吸附,再利用咪唑置換,洗脫下特異性結(jié)合的蛋白,見圖4。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的純化1:蛋白 marker;2:BL21中未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET32a(+)-Rv0867c的表達(dá)產(chǎn)物;3:BL21中誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET32a(+)-Rv0867c的表達(dá)產(chǎn)物;4:pET32a(+)-Rv0867c表達(dá)產(chǎn)物裂解后上清;5:pET32a(+)-Rv0867c表達(dá)產(chǎn)物裂解后沉淀;6,7:重組質(zhì)粒pET32a(+)-Rv0867c表達(dá)產(chǎn)物的純化蛋白Fig.4 Purification of expression product1:Protein marker;2:Expression product of pET32a(+)-Rv0867c without induction in BL21;3:Expression product of induced pET32a(+)-Rv0867c in BL21;4:Supernatant of induced BL21 that transformed pET32a(+)-Rv0867c;5:Precipitatant of induced BL21 that transformed pET32a(+)-Rv0867c;6,7:Purified protein ofexpression productof pET32a(+)-Rv0867c in BL21

3 討 論

Rpf蛋白與MTB休眠菌的復(fù)蘇密切相關(guān)[2],該蛋白可通過其具有的肽聚糖水解酶活性發(fā)揮功能,促進(jìn)細(xì)菌的生長,同時(shí)還可被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別并引起抗 Rpf的免疫反應(yīng),從而可能抑制MTB的生長[4-5]。因此,該類蛋白可作為新的靶點(diǎn)來預(yù)防和治療結(jié)核病。目前對(duì)它進(jìn)行研究的意義不僅僅是闡明微生物的一種生理現(xiàn)象,而更重要的是希望找到預(yù)防結(jié)核病和快速檢測MTB感染的有效途徑。

MTB的5個(gè)Rpf樣蛋白在大小和結(jié)構(gòu)上雖然有所差別,但它們都包含一段由大約70個(gè)氨基酸組成的高度保守區(qū)域[7]。有學(xué)者采用基因剔除的方法分別構(gòu)建了5種Rpf基因突變的MTB菌株,發(fā)現(xiàn)單個(gè)Rpf基因的刪除對(duì)MTB的生長沒有明顯影響,而5種Rpf基因均刪除或者部分刪除(如A、B、C或者A、C、D)時(shí),MTB的生長受到明顯影響[8-10],提示這5種Rpf樣蛋白在功能上有一定的重疊和互補(bǔ)。因此,這5種Rpf都有必要進(jìn)行深入研究。研究顯示,RpfA和RpfD被認(rèn)為是分泌到細(xì)胞外的,其余的3種則被認(rèn)為是附著在細(xì)胞表面。在細(xì)菌復(fù)蘇早期5種Rpf都能分泌,但RpfA和RpfD在此時(shí)達(dá)到最大分泌量[1,7]。Rv0867c基因保守序列之后有一個(gè)富含脯氨酸和丙氨酸的序列,表達(dá)受到一種屬于cAMP受體蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子(Rv3676)的調(diào)節(jié)[11],其編碼的蛋白R(shí)pfA不僅與細(xì)菌的增殖有關(guān),還有可能是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的一個(gè)靶抗原。因此,我們表達(dá)純化了RpfA蛋白,并進(jìn)行生物學(xué)研究,以期為制備結(jié)核病新型疫苗和建立結(jié)核病快速診斷方法找到理想的靶抗原。

根據(jù)MTB全基因組序列設(shè)計(jì)Rv0867c的特異性引物序列,通過基因擴(kuò)增酶切鑒定、序列分析、克隆表達(dá),成功構(gòu)建了pET32a(+)-Rv0867c表達(dá)載體。pET32a(+)是一種融合表達(dá)質(zhì)粒,能夠在外源蛋白N端編碼6個(gè)組氨酸殘基,并能編碼硫氧還原蛋白(Trx)與外源蛋白融合表達(dá)。硫氧還原蛋白的分子量為22 kDa,使重組蛋白分子量變大,不易被細(xì)菌內(nèi)的蛋白酶降解,從而提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性;同時(shí),外源蛋白與 Trx之間還具有腸激酶和凝血酶的識(shí)別位點(diǎn),可以方便的切下 Trx使重組蛋白的構(gòu)象更接近天然構(gòu)象。經(jīng)SDS-PA GE電泳證實(shí)獲得了結(jié)核分枝桿菌Rv0867c基因的表達(dá)蛋白,可能是形成了二聚體的包涵體,從而造成了表觀分子量的2倍增加,該蛋白以包涵體的形式存在。由于該融合蛋白含有6個(gè)組氨酸殘基,用Anti-His Tag單抗來初步鑒定融合蛋白的表達(dá),同時(shí)用抗Rpf結(jié)構(gòu)域單抗和病人血清進(jìn)一步鑒定 RpfA與Rpf結(jié)構(gòu)域抗體的反應(yīng)性。

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