從人源大容量天然抗體庫(kù)中篩選到抗禽流感病毒 H5N1單鏈抗體＊

孫麗娜,于 禮,張 黎 ,李 川 ,李德新 ,梁米芳

抗體庫(kù)的種類(lèi)可分為免疫抗體庫(kù)和非免疫抗體庫(kù),免疫抗體庫(kù)技術(shù)是指從經(jīng)過(guò)抗原免疫的動(dòng)物血液淋巴細(xì)胞中分離針對(duì)抗原的抗體基因的技術(shù);非免疫抗體庫(kù)包括天然大容量抗體庫(kù)和合成抗體庫(kù),它是一種不經(jīng)過(guò)免疫就能獲得針對(duì)某種抗原的基因工程抗體的技術(shù)[1]。最早建立的天然庫(kù)以?xún)蓚€(gè)正常人外周血淋巴細(xì)胞為材料,初步篩選出針對(duì)三種不同抗原的抗體[2]。對(duì)于一些自身免疫原引起的疾病(如癌癥、自身免疫疾病和心血管疾病)以及快速獲得突發(fā)新發(fā)傳染病治療或診斷用抗體的應(yīng)急儲(chǔ)備庫(kù),非免疫抗體庫(kù)尤其是天然抗體庫(kù)技術(shù)顯示了良好的應(yīng)用前景[3]。

禽流感病毒是一種球形或桿狀、有包膜的單股負(fù)鏈 RNA病毒,屬于正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒,其基因組分為8個(gè)節(jié)段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA識(shí)別靶細(xì)胞表面受體并與受體相結(jié)合,具有與宿主細(xì)胞膜融合活性,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[4-5]。有研究表明人源及人源化中和性抗禽流感病毒 H5N1單克隆抗體對(duì)小鼠有良好保護(hù)和治療效果[6-7]。因而,從人源大容量天然抗體庫(kù)中利用高通量的篩選策略在短時(shí)間內(nèi)獲得抗禽流感病毒H5N1人源單抗,對(duì)于新發(fā)傳染病的緊急預(yù)防和治療是十分必要和可行的。本研究利用人源大容量天然抗體庫(kù),采用噬菌體表面展示技術(shù),以 H5N1禽流感病毒安徽株 HA為抗原,最終得到了5株針對(duì)HA的噬菌體抗體基因,為高致病性禽流感病毒H5N1的預(yù)防和治療帶來(lái)了希望。

1 材料與方法

1.1 材料 人源大容量天然抗體庫(kù) HAL4/7由德國(guó)布倫瑞克大學(xué)生物技術(shù)研究所構(gòu)建[8],該抗體庫(kù)庫(kù)來(lái)源于44個(gè)健康人淋巴細(xì)胞,容量為5×109,抗體庫(kù)篩選時(shí)投入2個(gè)分開(kāi)構(gòu)建并用高效噬菌體Hyperphage包裝的抗體庫(kù)子庫(kù)[9],分別為5×1012HAL4庫(kù)即為VL kappa型和5×1012HAL7庫(kù),即為VL lambda型(重鏈為 VH1,VH2,VH3,VH4,V H5,VH6混合分別與kappa和lambda輕鏈庫(kù)混合構(gòu)建)。攜帶人源 Fc段的表達(dá)載體 pCMV-hIgG1-Fc-XP由德國(guó)布倫瑞克大學(xué)生物技術(shù)研究所構(gòu)建并惠贈(zèng)[10]。MDCK細(xì)胞及293T細(xì)胞來(lái)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)中心(A TCC)。禽流感病毒 A/Anhui/1/2005(H5N1)及人流感病毒 A/Hubeihs/53/2005(H1N1)和A/Yunnan/1145/2005(H3N2)感染MDCK細(xì)胞后制成病毒抗原片以及昆蟲(chóng)-桿狀病毒重組表達(dá)的禽流感血凝素蛋白 HA(A/Anhui/1/2005)抗原片均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供并保存,詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選 富集篩選方法基本按文獻(xiàn)[12]進(jìn)行,具體如下:用 1×PBS(p H 7.2)的溶液包被純化的 HA 抗原(2μg/孔),每孔150μl,4℃過(guò)夜;次日用 4%的BSA蛋白溶液于37℃封閉 2 h,棄封閉液;每孔加入 150μL噬菌體抗體庫(kù),37℃孵育2 h,棄去未結(jié)合的噬菌體,用1×PBST(1×PBS,0.5%Tween 20,p H 7.2)充分洗去未吸附的噬菌體10～30遍;每孔加入 150μL Gly-HCl(p H2.2)的洗脫液,室溫震蕩洗滌 10 min。加入適量的2 mol/L Tris,以中和洗脫下來(lái)的噬菌體;將洗脫的噬菌體立即加入 5 mL新鮮制備的XLI-Blue菌液中(OD600=0.7),靜置15～20min;37℃震蕩培養(yǎng)1 h,立即取10μL涂2YT-GA(終濃度100μg/mL氨芐青霉素,20 mmol/L葡萄糖)平板,以計(jì)算產(chǎn)出量;其余涂2YT-GA平板,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日將平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌刮下,取刮下的細(xì)菌加入到100 ml的2YT-GA液體培養(yǎng)基中使OD600=0.3,繼續(xù)培養(yǎng)使 OD600=0.5,加入輔助噬菌體M13K07(滴度為 1012/mL)200μL,37℃靜置 15～20 min,800 r/min振蕩培養(yǎng) 1 h,加入卡那霉素(終濃度70μg/mL),30℃培養(yǎng)過(guò)夜。如此反復(fù)篩選3次。

1.2.2 scFv噬菌體抗體結(jié)合活性的phage-ELISA檢測(cè) 挑取單個(gè)克隆到150μL 2YT-GA液體培養(yǎng)基的深孔板于 37℃培養(yǎng)過(guò)夜,第2d轉(zhuǎn)接菌液10μL到150μL 2YT-GA液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2 h,加入 M13K07使MOI達(dá)到20∶1,37 ℃靜置15 min,37℃800r/min搖1 h,補(bǔ)加1倍體積的2YTGA液體培養(yǎng)基,加入卡那霉素(終濃度70μg/mL)30℃過(guò)夜培養(yǎng),培養(yǎng)液離心后得到的上清用來(lái)檢測(cè)。用0.1mol/L NaHCO3(p H 9.6)的溶液包被HA抗原,125ng/孔,4℃過(guò)夜;4%脫脂奶封閉,37℃1 h,加入呈現(xiàn)的 scFv噬菌體抗體,37℃孵育1 h;加入酶標(biāo)抗M 13二抗(美國(guó) Sigma,1∶4 000稀釋使用),37℃1 h;顯色液顯色,2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A450值。

1.2.3 單鏈抗體 scFv基因序列分析 經(jīng)過(guò)phage-ELISA特異性鑒定得到的針對(duì) HA的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序的結(jié)果用DNASTAR序列分析軟件進(jìn)行分析,然后用Mega3.0對(duì)序列進(jìn)行 ClustalW分析,對(duì)相同的序列進(jìn)行合并,對(duì)合并后的序列與V-Base基因庫(kù)中的 IgG序列進(jìn)行比較。

1.2.4 scFv-Fc抗體重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

挑選phage-ELISA針對(duì) HA特異性鑒定陽(yáng)性克隆,經(jīng)NcoI/N otI雙酶切,克隆入攜帶人源 Fc段的表達(dá)載體 pCMV-hIgG1-Fc-XP[11],構(gòu)建成 scFv-Fc融合抗體表達(dá)載體。采用LipofectamineTM 2 000試劑盒(美國(guó),Invitrogen)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,操作方法略述如下:將 0.8～1μg重組質(zhì)粒 DNA加入50μLOPTIMEMI 中,然 后 將 2 ～ 3μLLipofectamine試劑加入 50μL OPTIMEMI中,5min后兩者混合均勻,室溫放置20min。將混合好的含目的質(zhì)粒及Lipofectamine的混合液輕輕加入到清洗過(guò)的細(xì)胞密度達(dá)到90%～95%單層293T細(xì)胞中,輕輕混勻后37℃,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后,加入含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后48h,收獲細(xì)胞,用免疫熒光(IFA)檢測(cè)。

1.2.5 ELISA檢測(cè)scFv-Fc抗體與抗原的結(jié)合特異性 用0.1 mol/L NaHCO3(p H9.6)的溶液包被純化 HA(A/Anhui/1/2005)和滅活 H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005),4℃過(guò)夜;4%脫脂奶封閉,37℃1 h,加入 scFv-Fc抗體表達(dá)上清,37℃孵育1 h,加入酶標(biāo)抗人Fc二抗(美國(guó) Sigma,1∶2 000稀釋),37℃1 h;顯色液顯色,2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度 A450值。

1.2.6 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè) scFv-Fc抗體與抗原的結(jié)合特異性 高致病性禽流感病毒 A/Anhui/1/2 005(H5N1)及人流感病毒A/Hubeihs/53/2005(H1N1)和A/Yunnan/1145/2005(H3N2)感染MDCK細(xì)胞后制成病毒抗原片;同時(shí)利用已構(gòu)建的表達(dá)禽流感血凝素蛋白 HA(A/Ahui/1/2005)重組桿狀病毒感染 Sf9細(xì)胞,4～5d后收獲感染細(xì)胞制成重組 HA抗原片。加入scFv-Fc抗體表達(dá)上清,37℃溫育 30 min,沖洗,加入FITC標(biāo)記的抗 Fc抗體(美國(guó) Sigma),37℃溫育30 min,沖洗,晾干,顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 人源大容量天然抗體庫(kù)的富集篩選 用純化的 H5N1禽流感病毒 HA抗原(A/Anhui/1/2005)對(duì)天然人源抗體庫(kù)進(jìn)行了3輪富集篩選。針對(duì)HA抗原,第一、二、三輪篩選分別產(chǎn)出 3.2×103,5.5×104,2.4 ×105個(gè)克隆,見(jiàn)表1。

表1 3輪篩選的產(chǎn)出量比較Tab.1 Phage antibody output in three rounds of screening

在第三輪富集的基礎(chǔ)上挑選 1 500個(gè)克隆,經(jīng)phage-ELISA鑒定表明,針對(duì) HA抗原得到82個(gè)陽(yáng)性克隆,經(jīng)測(cè)序表明這82個(gè)克隆分別屬于5個(gè)不同的抗體序列,即為5個(gè)唯一序列的抗體克隆。

2.2 人源抗禽流感病毒 H5N1 scFv單鏈抗體的序列分析 用DNASTAR、Mega3.0序列分析軟件進(jìn)行分析處理,比較 Internet V-Base基因庫(kù)中的IgG序列,上述82株特異性結(jié)合 H5N1禽流感病毒HA的人源scFv單克隆抗體中,分別屬于5個(gè)不同的抗體序列,因此共發(fā)現(xiàn)5株帶有不同的抗體輕重鏈可變區(qū)序列及其組合的抗體,其重鏈可變區(qū)分類(lèi)在 IgG V H1和 VH3家族,其輕鏈可變區(qū)分類(lèi)在IgG VL1和 VL6家族。這 82株抗體中,有 47株相同序列的克隆命名為 AVFluscFv01,其余19株、7株、5株、4株相同序列的克隆分別名為 AVFluscFv04,AVFluscFv02,AVFluscFv03,AVFluscFv05,這5株抗體在篩選中的分布如圖 1,其輕重鏈可變區(qū)CDR3氨基酸序列見(jiàn)表2。

圖1 5株單鏈抗體在篩選中的分布Fig.1 The distribution of the 5 scFv antibodies against HA(A/Anhui/1/2005)in screening

表2 抗禽流感病毒scFv抗體輕重鏈可變區(qū)CDR3氨基酸序列Tab.2 Amino acid sequences of variable regions CDR3 in the Hand L chains of H5N1 virus-specific scFvs

2.3 人源抗 H5N1禽流感病毒scFv-Fc抗體的表達(dá) 將5株針對(duì) HA陽(yáng)性的克隆,經(jīng)NcoI/NotI雙酶切,克隆入攜帶人源 Fc段的表達(dá)載體 pCMV-hIgG1-Fc-XP,轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞,實(shí)現(xiàn) scFv-Fc抗體的分泌型表達(dá),分別命名為AVFluscFv/Fc01、AVFluscFv/Fc02、 AVFluscFv/Fc03、 AVFluscFv/Fc04、AVFluscFv/Fc05,分泌表達(dá)載體的模式圖如圖2所示。轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞用FITC-抗人Fc抗體檢測(cè),觀察到陽(yáng)性熒光反應(yīng),表明 H5N1禽流感scFv-Fc抗體在293T細(xì)胞中得到完整表達(dá),見(jiàn)圖2。

2.4 人源抗 H5N1禽流感病毒scFv-Fc抗體的結(jié)合特性 (ELISA檢測(cè)) 為了證明所獲得的重組抗體以 scFv-Fc融合抗體形式分泌表達(dá)后也能對(duì)H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)及其HA抗原有特異性結(jié)合,我們將scFv-Fc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收獲的表達(dá)上清,并利用 ELISA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,最后獲得 5株scFv-Fc抗體能夠穩(wěn)定而且特異性結(jié)合 H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)及其 HA抗原,而與無(wú)關(guān)抗原BSA無(wú)交叉反應(yīng),結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 免疫熒光檢測(cè)人源抗 H5N1禽流感病毒 scFv-Fc抗體的表達(dá)Fig.2 IFA detecting expression of scFv-Fc antibodyagainst avian influenza A(H5N1)virusA:Using FITC conjugated anti-human Fc to detect the anti-H5N1 scFv-Fc antibody;B: Normal 293T cells

圖3 ELISA檢測(cè)人源抗 H5N1禽流感病毒scFv-Fc抗體的結(jié)合特性Fig.3 ELISA test detecting binding of 5 scFv-Fc antibodies with H5N1 virus and HA

2.5 人源抗 H5N1禽流感病毒 scFv-Fc抗體的結(jié)合特性 (IFA鑒定) 為了證實(shí)所獲得的重組scFv-Fc融合抗體對(duì)禽流感病毒 H5N1的結(jié)合特異性,我們進(jìn)一步通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定真核表達(dá) scFv-Fc融合抗體的功能活性。結(jié)果表明,5株人源 scFv-Fc抗體(AVFluscFv/Fc01、AVFluscFv/Fc02、 AVFluscFv/Fc03、 AVFluscFv/Fc04、AVFluscFv/Fc05)與安徽株禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005)及其重組 HA免疫熒光均為陽(yáng)性,與甲1型人流感病毒A/Hubeihs/53/2005(H1N1)及甲3型人流感病毒 A/Yunnan/1145/2005(H3N2)免疫熒光均為陰性,如圖3所示AVFluscFv/Fc01免疫熒光結(jié)果,其余4株抗體免疫熒光結(jié)果與AVFluscFv/Fc01相同。免疫熒光結(jié)果證明從抗體庫(kù)篩選獲得的陽(yáng)性克隆均針對(duì) H5N1禽流感病毒血凝素蛋白 HA,而與甲1型和甲3型人流感病毒無(wú)交叉反應(yīng)的人源單抗。

圖4 抗禽流感病毒 H5N1人源scFv-Fc抗體與禽流感病毒 H5N1及其重組 HA以及流感病毒 H1N1、H3N2的免疫熒光反應(yīng)Fig.4 Immunofluorescence assay analysis of human scFv-Fc antibody binding activities to H5N1,H1N1 and H3N2 viruses and the recombinant expressed HA of the H5N1 virus

3 討 論

本研究采用噬菌體表面展示技術(shù),以 H5N1禽流感病毒安徽株HA為抗原,從人源大容量天然抗體庫(kù)中篩選抗 HA的基因工程抗體。篩選中所投入抗體庫(kù)為人源大容量天然抗體庫(kù),其構(gòu)建參見(jiàn)文獻(xiàn)[8],該抗體庫(kù)來(lái)源于44個(gè)健康人淋巴細(xì)胞,容量為5×109,抗體庫(kù)利用高效噬菌體 Hyperphage包裝[9],大大提高了重組抗體在噬菌體表面展示的效率,進(jìn)而提高了后續(xù)陽(yáng)性克隆的篩選效率。本研究獲得的82株特異性結(jié)合 H5N1禽流感病毒 HA的人源 scFv單克隆抗體中,分別屬于 5個(gè)不同的抗體序列,即共發(fā)現(xiàn)5株帶有不同的抗體輕重鏈可變區(qū)序列及其組合的抗體,其重鏈可變區(qū)分類(lèi)在 IgG VH1和 VH3家族,其輕鏈可變區(qū)分類(lèi)在 IgG VL1和VL6家族。

抗體在體內(nèi)的作用是一個(gè)綜合作用,一方面是通過(guò)和病毒的結(jié)合阻礙病毒的傳播,另一方面,Fc段是抗體分子發(fā)揮功能的重要元件,包括抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解作用。這些作用依靠全抗體分子中的Fc片段的存在,所以我們將5株人源單鏈抗體scFv基因克隆入攜帶人源Fc段的表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)scFv-Fc融合抗體的分泌型表達(dá),短時(shí)間內(nèi)完善了抗體功能及下游檢測(cè)方面的需求。為了證實(shí)所獲得的重組scFv-Fc融合抗體對(duì)禽流感病毒 H5N1的結(jié)合特異性,我們選擇了較為典型 H1、H3、H5三種流感病毒株以及 H5亞型重組表達(dá)的血凝素 HA抗原與篩選獲得的人源單抗進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示從抗體庫(kù)篩選獲得的5株人源單抗與禽流感病毒 H5N1及其 HA具有較好的特異性,而與甲1型和甲3型人流感病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

天然大容量抗體庫(kù),是一種不經(jīng)過(guò)免疫就能獲得針對(duì)某種抗原的基因工程抗體的技術(shù)[1],可以分離到針對(duì)自身抗原、無(wú)免疫原性或毒性抗原的抗體;抗體產(chǎn)生時(shí)間短,在庫(kù)容量足夠大的時(shí)候可以獲得高親和力抗體。本研究從人源大容量天然抗體庫(kù)中利用高通量的篩選策略在短時(shí)間內(nèi)成功獲得了抗禽流感病毒 H5N1人源單抗,因此非免疫抗體庫(kù)尤其是天然抗體庫(kù)成為快速獲得突發(fā)新發(fā)傳染病治療或診斷用抗體的應(yīng)急儲(chǔ)備庫(kù)。目前我們已經(jīng)獲得了抗H5N1禽流感病毒scFv基因所對(duì)應(yīng)的全抗體基因,體外的中和試驗(yàn)及其 HA抗原表位方面的鑒定也在進(jìn)行當(dāng)中。

[1]Lee CV,Liang WC,Dennis MS,et al.High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold [J].J Mol Biol,2004,340(5):1073-1093.

[2]Aujame L,Geoffroy F,Sodoyer.High affinity human antibodies by phage display[J].Human Antibody,1997,8:155-168.

[3]de Haard HJ,Van Neer N,Reurs A,et al.A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies[J].J Biol Chem,1999,274:18218-18230.

[4]Wiley D C,Skehel J J.The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus[J].Annu Rev Biochem,1987,56:365-394.

[5]Skehel J J,Wiley D C.Receptor binding and membrane fusion in virus entry:the influenza hemagglutinin[J].Annu Rev Biochem,2000,69:531-569.

[6]Simmons P C,Bernasconi N L,Suguitan AL,et al.Prophylactic and therapeutic efficacy of human monoclonal antibodies against H5N1 influenza[J].Plos Med,2007,4(5):0928-0936.

[7]Hanson B J,Boon A C,Lim AP,et al.Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice[J].Respir Res,2006,7:126-127.

[8]Hust M,Toleikis L,Du bel S.Antibody phage display.Handbook of therapeutic antibodies[M].Weinheim:Wiley-VCH,2007:45-68.

[9]Pelat T,Hust M,Laffly E,et al.A high affinity,human like antibody fragment(scFv)neutralising lethal factor(LF)of Bacillus anthracis by inhibiting the PA-LF complex formation[J].Antimicro Agents Chem,2007,51:2758-2764.

[10]Thomas Schirrmann,Konrad B S.Transient Production of scFv-Fc Fusion Proteins in Mammalian Cells.Antibody Engineering[M].2010,Part III,387-398.

[11]孫麗娜,劉琴芝,王敏,等.人源中和性抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程全抗體的研制 [J].病毒學(xué)報(bào),2008,24(3):165-171.

[12]Hust M,Dübel S,Schirrmann T.Selection of recombinant antibodies from antibody gene libraries[J].Methods Mol Biol,2007,408:243-255.