酵母發(fā)酵過程中海藻糖的定性與定量測定

安 寧, 葛向陽, 張偉國

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

酵母發(fā)酵過程中海藻糖的定性與定量測定

安 寧, 葛向陽, 張偉國＊

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

應(yīng)用紙層析對酵母提取液中海藻糖進(jìn)行了定性分析,并應(yīng)用蒽酮硫酸比色-DNS比色法對酵母提取液中海藻糖進(jìn)行了定量測定,確定了海藻糖定性定量的條件。研究結(jié)果經(jīng)與 HPLC分析結(jié)果驗(yàn)證,表明該法對測定海藻糖含量具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,而且該法操作簡單,易于掌握,比較適合在海藻糖產(chǎn)生菌篩選中應(yīng)用。

海藻糖;DNS比色;蒽酮硫酸比色;紙層析;HPLC

海藻糖(Trehalose)是由兩個(gè)葡萄糖分子通過半縮醛羥基結(jié)合而成的非還原性雙糖[1],廣泛存在于細(xì)菌、藻類、酵母、低等植物、昆蟲和其他無脊椎動(dòng)物中,尤其在霉菌、蘑菇等真菌中含量高達(dá)干重的20%[2]。海藻糖的性質(zhì)非常穩(wěn)定,具有耐干燥、耐冷凍、保濕、低熱值[3]等不同于其它碳水化合物的獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì),使得海藻糖在食品、醫(yī)藥工業(yè)、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[4]有著廣闊的應(yīng)用前景。

但是,由于海藻糖是一種非還原性二糖,在分子結(jié)構(gòu)上與蔗糖比較接近,一般采用 HPLC對其進(jìn)行精確定量分析。但是,使用 HPLC分析,不但操作成本高,而且樣品制備比較繁瑣,不適用于海藻糖生產(chǎn)菌的篩選。作者將采用紙層析法應(yīng)用于海藻糖生產(chǎn)菌的篩選工作中,經(jīng)過 HPLC分析驗(yàn)證,該法不但操作簡單,而且重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性都達(dá)到了較為理想的水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株 釀酒酵母(Saccharom yces cere-visiae)3株,江南大學(xué)生物工程學(xué)院代謝調(diào)控與代謝工程研究室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(組分 g/L):葡萄糖10,酵母膏 5,蛋白胨 10,KH2PO43;發(fā)酵培養(yǎng)基(組分 g/L):葡萄糖 30,玉米漿 11,酵母膏 1,KH2PO40.9,NaH2PO41.5,M gSO4·7H2O 0.15。培養(yǎng)基調(diào)p H 5.0～5.5。種子培養(yǎng)基在0.07 M Pa下滅菌15 m in,發(fā)酵培養(yǎng)基在0.1 M Pa下滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 721分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠產(chǎn)品;立式圓形壓力蒸汽滅菌器,上海醫(yī)用核子儀器有限公司產(chǎn)品;往復(fù)式搖床,無錫查橋輕機(jī)廠產(chǎn)品;超凈工作臺,蘇凈集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品;PHS-3C型精密p H計(jì),上海雷磁儀器廠產(chǎn)品;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。電熱恒溫水浴鍋,上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品;Agilent1100,美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母提取液的制備 將培養(yǎng)離心后的適量酵母泥置于燒杯中均勻鋪成薄層,放入90℃烘箱中處理60 min。然后以固液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL加預(yù)冷的去離子水,搖勻后42℃水浴20 min,取出后6 000 r/min離心10 min即得酵母海藻糖提取液[5]。

1.2.2 DNS測還原糖[6]

1)稱取酒石鉀鈉182.0 g,溶于500 mL蒸餾水中,加熱(不超過50℃),于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g,NaOH 21.0 g,苯酚5.0 g,無水亞硫酸鈉5.0 g,攪拌至溶解完全,冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL,貯存于棕色瓶中,室溫保存。

2)1 mg/m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液:準(zhǔn)確稱取105℃烘至恒重的葡萄糖1 g,加少量水溶解后再加8 m L濃鹽酸,以蒸餾水定容至1 000 m L。

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液為基準(zhǔn)液,取數(shù)支試管進(jìn)行2～10倍系列稀釋。分別去稀釋液0.5 mL,加入DNS試劑0.5 mL,混合均與后沸水浴5 min,取出立即冷卻并加入8 mL蒸餾水,于540 nm處測定各管吸光值。以A540nm對葡萄糖質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖1。

4)還原糖的測定:將酵母提取液直接以DNS法測定光密度值,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出還原糖的量[7]。

1.2.3 蒽酮-硫酸法測總糖[8]

1)蒽酮-硫酸溶液的配制:稱取蒽酮0.2 g,加濃硫酸100 mL,混勻即可(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

2)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的配制:精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖配制成濃度為1.00 mg/m L的溶液 ,備用。

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:以上述標(biāo)準(zhǔn)液為基準(zhǔn)配制0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06 mg/mL的葡萄糖溶液各2.00 m L,搖勻,各管分別加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的蒽酮-硫酸試劑8 m L與沸水浴中加熱10 min(從水浴重新沸騰算起),取出,用自來水冷卻,在630 nm處以首管作空白,測定吸光度。以A630nm對葡萄糖質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖2。

4)總糖的測定:將酵母提取液稀釋100倍,按上述操作測A630nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出酵母提取液中總糖的含量。

1.2.4 蒽酮-硫酸法測海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1)標(biāo)準(zhǔn)海藻糖溶液的配制:精密稱取干燥至恒重的無水海藻糖配制成濃度為1.00 mg/mL的溶液 ,備用。

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:具體同上述操作。以A630nm對海藻糖質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖3。

1.2.5 紙層析法[9]

1)試劑配制

展開劑:V(正丁醇)∶V(丙酮)∶V(水) ∶V(醋酸)=10∶6∶6∶2。

顯色劑:A液:AgNO3的水-丙酮飽和溶液,V(水)∶V(丙酮)=1∶200

B液:將1 g NaOH晶體溶于100 g乙醇水溶液中 ,m(乙醇)∶m(水)=1∶1。

2)層析操作:取長33 cm,寬15 cm的層析濾紙條上,于起始線(起始線距濾紙末端5 cm)上分別用海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品和提取液相距1 cm點(diǎn)樣,斑點(diǎn)直徑不得超過5 mm,越小越好。點(diǎn)樣量為葡萄糖2μg、蔗糖10μg、海藻糖4μg、提取液40μL。吹干后,至于展開劑飽和的層析缸中,上行展開層析數(shù)小時(shí),待展開劑距起始線32 cm的前沿線上時(shí),取出。自然風(fēng)干,先在濾紙條上均勻噴上A液,50℃烘干,再均與噴上B液,再烘干,數(shù)分鐘后,棕黃色的濾紙上便顯出樣品的斑點(diǎn)。

1.2.6 HPLC色譜分析條件 色譜柱:NH2鍵合相柱,5 m L,250 mm×4.6 mm;流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水)=70 ∶30;流量:1 m L/min;柱溫:25 ℃;檢測器:視差折光檢測器[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNS測得還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

DNS測得還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 DNS測定葡萄糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose measurement by DNS

2.2 蒽酮測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

蒽酮測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 蒽酮測定葡萄糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of glucose measurement by anthrone-sulfuric method

2.3 蒽酮硫酸法測得海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

蒽酮硫酸法測得海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 蒽酮測定海藻糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of trehalose measurement by anthrone-sulfuric method

表1 蒽酮硫酸法測得酵母提取液中總糖的質(zhì)量濃度及對應(yīng)的吸光值Tab.1 Total carbohydrates content and relevant OD level by anthrone-sulfuric method

表2顯示2#酵母提取液非還原糖含量最高,3#酵母提取液含量其次,1#最低。

表2 DNS法測得還原糖的質(zhì)量濃度及A值差值對應(yīng)非還原糖的質(zhì)量濃度Tab.2 Reducing sugar level and nonreducing sugar level by DNS

2.4 紙層析圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,酵母提取液中都有與海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品值相同的斑點(diǎn),這表明酵母提取液中有海藻糖成分。斑點(diǎn)的大小與所點(diǎn)樣品的量有關(guān),通過紙層析觀察3株酵母海藻糖合成能力的大小。圖4結(jié)果顯示:2#酵母的斑點(diǎn)最大,3#酵母的斑點(diǎn)其次,1#酵母的斑點(diǎn)最小,對應(yīng)外加30μg的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液層析得到的圖譜2#最大,3#次之,1#最小,所得結(jié)果與用吸光度計(jì)算得的結(jié)果完全一致。

2.5 HPLC視差折光檢測器檢測法分離測定海藻糖、葡萄糖、蔗糖的色譜結(jié)果

為了準(zhǔn)確測定細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量,作者采用HPLC對其進(jìn)行了定量分析比對上述測量結(jié)果。

3株酵母中2#酵母產(chǎn)海藻糖能力最強(qiáng),3#酵母其次,1#酵母最弱。由圖5～圖9的HPLC圖和表3可看出,1#酵母提取液中葡萄糖的含量最高,海藻糖含量相對低,由此可知,1#酵母海藻糖的轉(zhuǎn)化能力也較弱。3#酵母提取液中雖然海藻糖占總糖的比率較高,但是蔗糖等雜峰較多,相比而言2#酵母最為理想,雜峰少,海藻糖產(chǎn)量高,轉(zhuǎn)化率也較高。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)樣品與酵母提取物的紙層析對照圖譜Fig.4 Comparison of paper chromatography between standard sample and yeast extract

圖5 葡萄糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC圖Fig.5 Chromatogram of standard sample of glucose and sucrose

圖6 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC圖Fig.6 Chromatogram of standard sample of trehalose

此外,就葡萄糖、蔗糖和海藻糖3種糖而言,2#和1#酵母中總糖含量較高,約為7.3 m g/m L和7.2 mg/mL,而3#酵母提取液中總糖為4.2 mg/m L,可以粗略地說明1#和2#酵母的耐糖能力較強(qiáng)。

圖7 1#酵母提取液液 HPLC圖Fig.7 Chromatogram of sample prepared by the first yeast

圖8 2#酵母提取液 HPLC圖Fig.8 Chromatogram of sample prepared by the second yeast

圖9 3#酵母提取液 HPLC圖Fig.9 Chromatogram of sample prepared by the third yeast

對比表2和表3發(fā)現(xiàn),用DNS和蒽酮硫酸法測得的非還原糖的含量和 HPLC中海藻糖的含量相差不大,由 HPLC結(jié)果知3株酵母的酵母提取液中蔗糖與海藻糖的比為55.2%,13.5%,31.5%,其中2#酵母蔗糖含量最小,而海藻糖產(chǎn)量最高,因此,可選2#酵母進(jìn)行下一步研究以提高產(chǎn)量。由圖中各標(biāo)準(zhǔn)曲線得知,各波長處的吸光度與糖含量的正相關(guān)線性程度很高;糖成分清晰的2#酵母提取液用兩種方法測得的含量分別為4.2 mg/m L和4.8 mg/m L,排除來自兩種測量方法中由處理方法不同而帶來的誤差。所以,相對于 HPLC方法,該法對初步測量酵母海藻糖的含量有較高的準(zhǔn)確度和精密度。由于海藻糖是應(yīng)激性糖在非還原糖中的含量是主要的,所以在酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化等脅迫因素的刺激下含量會(huì)更高,蔗糖與海藻糖的含量比值減小,那么DNS和蒽酮硫酸法測得的數(shù)值則更趨近于HPLC所測得的數(shù)值。

表3 3株酵母提取液中主要糖類的質(zhì)量濃度Tab.3 Concentration of the main carbohydrates in yeast extract

3 結(jié) 語

海藻糖作為一種應(yīng)激代謝物,在營養(yǎng)缺乏,環(huán)境脅迫,生長受限的情況下才大量積累,其干重甚至占酵母干重的16%[10]。采用DNS和蒽酮硫酸法測得非還原糖的含量與 HPLC結(jié)果相似,可以簡便的測量海藻糖粗含量。另外通過觀察海藻糖紙層析圖中斑點(diǎn)的大小與亮度也可以粗略的判斷海藻糖的含量大小,這樣就大大降低了海藻糖生產(chǎn)菌初篩中的工作量和研究成本,該法比較適宜于大量潛力菌的篩選工作中。

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Qualitative and Quantitative Determination of Trehalose in Yeast Extract

AN Ning, GE Xiang-yang, ZHANG Wei-guo＊
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A method to determine trehalose in yeast extract using paper chromatography was investigated in this manuscript.Meanwhile,a process to determine the concentration of trehalose by Anthrone-sulphuric acid colorimetric method was developed.Compared to the results from HPLC,the paper chromatography method was identified as highly accurate and precise in the determination of trehalose.Therefore,the paper chromatography methods was proven to be easy operate and suitable for the screening of strains producing trehalose.

trehalose,DNS,anthrone-sulfuric method,paper chromatography,HPLC

TQ 92

A

1673-1689(2011)04-0636-05

2010-11-02

＊

張偉國(1963-),男,江蘇張家港人,工學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事氨基酸生產(chǎn)菌種選育及發(fā)酵工藝研究。Email:zhangw g@126.com