β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆與序列分析

孫軍濤, 王洪新, 呂文平＊, 馬朝陽(yáng), 戴易興, 姚紅

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆與序列分析

孫軍濤1,2, 王洪新1,2, 呂文平＊1,2, 馬朝陽(yáng)1,2, 戴易興1,2, 姚紅1,2

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

依據(jù)GenBank中收錄的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquef aciens)β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以提取的解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),將此目的基因克隆至p TG19-T Easy載體中,經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶鑒定和克隆片段的序列測(cè)定、比較,結(jié)果表明該克隆片段擴(kuò)增準(zhǔn)確、可靠。序列比較發(fā)現(xiàn),此片段與解淀粉芽孢桿菌(B.am y loliquefacines,M 15674)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢桿菌(B.licheniform is,A Y365256)分別有99%、95%和94%的同源性。

解淀粉芽孢桿菌;β-1,3-1,4-葡聚糖酶;克隆;序列分析

β-1,3-1,4-葡聚糖是禾本科高等植物(谷物類)細(xì)胞壁的多糖組分,是由1 200個(gè)以上的β-D-葡萄糖殘基通過(guò)β-1,3和β-1,4糖苷鍵連接而成的線性分子,在大麥、燕麥、高粱、大米和小麥等谷物胚乳細(xì)胞壁中的含量尤為豐富,不同谷物β-葡聚糖中兩種糖苷鍵鍵型的比例和寡糖單元的長(zhǎng)度有所不同,如大麥,90%以上的水溶性β-葡聚糖是由單一的β-1,3糖苷鍵連接纖維三糖和纖維四糖所組成[1]。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶 (1,3-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase, 1, 3-1, 4-glucanase,E.C.3.2.1.73,簡(jiǎn)稱β-葡聚糖酶或地衣多糖酶),它是只降解β-葡聚糖中與β-1,3糖苷鍵相鄰的β-1,4糖苷鍵的酶,其降解產(chǎn)物主要是纖維三糖和纖維四糖[2]。它是一種有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)用酶,在啤酒釀造中常用于糖化或發(fā)酵以提高啤酒質(zhì)量和穩(wěn)定性[3],并且作為飼料添加劑也能夠有效的提高飼料轉(zhuǎn)化率[4-5]。但是現(xiàn)有的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的耐熱性較差、酸性條件下活性較低,在工業(yè)應(yīng)用中,較高的加工溫度或酸性環(huán)境,就會(huì)使β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性降低甚至失活,限制了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的應(yīng)用范圍,增加生產(chǎn)成本。因此,開(kāi)發(fā)出在高溫、強(qiáng)酸條件下具有高活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶將具有很好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

許多不同來(lái)源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因已經(jīng)克隆得到,如芽孢桿菌屬[6-10]、球菌[11]和真菌[12]等,并在大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillus strains)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及其他轉(zhuǎn)基因植物大麥和煙草等不同宿主菌中進(jìn)行了表達(dá)。通過(guò)單一菌株的基因的克隆表達(dá)、定點(diǎn)誘變以及基因缺失等手段得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在耐熱、耐酸和活性方面不夠理想。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因重疊延伸PCR技術(shù)在基因工程中有很好的應(yīng)用,通過(guò)此技術(shù)采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)[13]。為了獲得工業(yè)生產(chǎn)條件下具有較高熱穩(wěn)定性的酶,將不同來(lái)源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因通過(guò)基因重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行雜合,構(gòu)建雜合基因工程菌,表達(dá)出適合工業(yè)生產(chǎn)需要的雜合酶將是一種較好的手段。

作者以解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為研究對(duì)象,克隆了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因,并對(duì)基因序列進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步構(gòu)建耐熱、耐酸高活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquef aciens)、DH5a由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,氯化鈉10。氨芐青霉素的使用濃度為100μg/m L,固體培養(yǎng)基按2%的量加入瓊脂。

限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI、T4 DNA 連接酶、TaqDNA 聚合酶、p TG19-T Easy Vector、DL 2000 M arker、小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖芯?gòu)于上海捷瑞生物工程公司;X-gal和IPTG購(gòu)于Sigma公司;其他主要試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀 PTC-2000:美國(guó)MJ公司產(chǎn)品;凝膠成像透射儀chemi system:美國(guó)UVP公司產(chǎn)品;One Drop Spectrophotometer OD-1000:上海采邑生物科技有限公司產(chǎn)品;冷凍氣浴恒溫振蕩器BS-1E:金壇市瑞華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢桿菌基因組DNA提取 活化的解淀粉芽孢桿菌接種到LB培養(yǎng)基中,37℃下200 r/mim振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,收集菌液按照小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑峁┑姆椒ㄌ崛〗獾矸垩挎邨U菌基因組DNA,用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用OD-1000紫外、可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度。

1.3.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因的PCR擴(kuò)增以提取的解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板,利用PCR擴(kuò)增β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因,反應(yīng)體系(50μL):10 ×PCR buffer 5μL,M gCl2(25 mmol/L)2.5μL,dN TP(10 mmol/L)1μL,引物各2μL,模板3μL,Taq酶(5 U/μL)0.5μL,重蒸水 34μL。PCR反應(yīng)條件:94℃2 min;94℃1 min;42℃1 min,每循環(huán)增加0.1℃,72℃1 min,重復(fù)30次;72℃10 min;4℃保存。

1.3.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收試劑盒回收目的基因片段,回收產(chǎn)物與p TG19-T vector 4℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物加入感受態(tài)DH5a中,冰浴30 min,42℃下熱激45 S,立即放入冰浴中5 min,加入800μL的LB培養(yǎng)基,37℃下200 r/mim振蕩培養(yǎng)1 h。將轉(zhuǎn)化好的菌液接種在含有氨芐青霉素的LB平板上(已經(jīng)涂過(guò)X-gal和IPTG)37℃過(guò)夜培養(yǎng),挑取白色菌落,接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒備用。

1.3.5 陽(yáng)性克隆的鑒定

1)PCR鑒定 以提取的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系和條件同基因擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2)BamH I和XhoI雙酶切鑒定 酶切反應(yīng)體系為:buffer 2μL,BamH I 1μL,Xho I1μL,克隆質(zhì)粒8μL,無(wú)菌水8μL;混勻,37 ℃酶切4 h后,65℃滅活15 min,酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.6 測(cè)序及序列分析 經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNA Tools軟件對(duì)β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列進(jìn)行分析,將推導(dǎo)的氨基酸序列與 Gen-Bank上發(fā)表的已知序列做同源性比較與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌基因的提取

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取的DNA進(jìn)行檢查可以清晰地看到特征性條帶,證明得到了解淀粉芽孢桿菌的基因。用OD-1000紫外、可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量濃度為215.33 ng/μL,A260和A280之比為1.954,符合1.8～2.0的要求,說(shuō)明DNA的純度較高,可用于PCR的擴(kuò)增。

2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因的 PCR擴(kuò)增

以解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增出的目的片段在750 bp左右,其條帶單一,特異性強(qiáng),表現(xiàn)與目的基因預(yù)期大小一致的條帶,瓊脂糖電泳圖如圖1。

2.3 陽(yáng)性克隆的鑒定

2.3.1 PCR鑒定 在LB平板上篩選白斑,得到一些陽(yáng)性克隆子。挑取得到的白斑于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2,克隆得到的基因片段與目的基因片段大小一致,說(shuō)明目的基因片段 bgl已經(jīng)插入到p TG19-T vector中。

圖1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因的 PCR擴(kuò)增Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR amplification product ofβ-1,3-1,4-glucanase gene

圖2 陽(yáng)性克隆子PCR鑒定電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis analysis of PCR amplification product of positive cloning plasm id

2.3.2BamH I和XhoI雙酶切鑒定 克隆載體經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3,與未經(jīng)酶切的克隆質(zhì)粒對(duì)比發(fā)現(xiàn),在750 bp左右出現(xiàn)明顯的條帶,進(jìn)一步證實(shí)β-1,3-1,4-葡聚糖酶目的基因已經(jīng)插入到p TG19-T vector中,成功獲得陽(yáng)性克隆子p TG19-T-bgl。

圖3 陽(yáng)性克隆子雙酶切電泳圖Fig.3 Restriction enzyme cutting of positive clon ing plasm id

2.4 測(cè)序結(jié)果及序列分析

序列測(cè)定結(jié)果表明,克隆得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶擴(kuò)增片段全長(zhǎng)為758 bp,已被 GenBank收錄(Accession A Y205562)。如圖4,與預(yù)期長(zhǎng)度相同。經(jīng)Blast同源性分析結(jié)果表明,克隆得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因與 GenBank登錄的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquef acines,M 15674)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢桿菌(B.licheniform is,A Y365256)分別有 99%、95%和94%的同源性。用DNA Tools分析表明,該基因ORF為717 bp,編碼239個(gè)氨基酸,計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量為26 807,等電點(diǎn)為6.51,其中疏水性氨基酸占36.8%,親水性氨基酸占44.8%,酸性氨基酸占8.8%,堿性氨基酸占9.6%。

圖4 解淀粉芽孢桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶核苷酸序列及其推譯的氨基酸序列Fig.4 The nucleotides sequence and its deduced amino acid sequence ofβ-1,3-1,4-glucanade from Bacillusamyloliquefaciens

3 結(jié) 語(yǔ)

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶,廣泛應(yīng)用于釀酒和飼料工業(yè)。β-葡聚糖在啤酒生產(chǎn)和飼料加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些問(wèn)題,如降低麥芽汁和啤酒過(guò)濾速度、影響啤酒風(fēng)味、在啤酒儲(chǔ)存過(guò)程中易引起沉淀;過(guò)多的β-葡聚糖增加飼料的粘性和不可消化性,降低飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在啤酒生產(chǎn)和飼料加工過(guò)程中,由于高溫、低p H的條件,往往使谷物內(nèi)源性β-1,3-1,4-葡聚糖酶失活,因此添加適量的耐熱、耐酸、活性高的β-1,3-1,4-葡聚糖酶能夠解決工業(yè)生產(chǎn)中β-葡聚糖引起的負(fù)面影響。但現(xiàn)有的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性、耐酸性較差,在釀酒和飼料工業(yè)應(yīng)用時(shí)增加了生產(chǎn)成本。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建適應(yīng)工業(yè)需要的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,降低其在釀酒和飼料工業(yè)應(yīng)用時(shí)的生產(chǎn)成本,已經(jīng)成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。

作者根據(jù) GenBank提供的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因已知序列,應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)特異性引物,運(yùn)用PCR及T-A克隆技術(shù)成功獲得了包含758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因片段,并與p TG19-T Easy Vector載體連接,經(jīng) PCR、酶切和測(cè)序鑒定,結(jié)果與 GenBank報(bào)告的序列完全一致,成功構(gòu)建出p TG19-T-bgl真核表達(dá)載體,為下一步構(gòu)建耐熱、耐酸、活性高的雜合β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis ofβ-1,3-1,4-Glucanase Gene

SUN Jun-tao1,2, WANG Hong-xin1,2, LV Wen-ping＊1,2,M A Chao-yang1,2, DA I Yi-xing1,2, YAO Hong1,2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Based on the sequence alignment ofBacillus amyloliquef aciens,two pairs of primers were designed and synthesized in this study.Using the total DNA ofBacillus amyloliquef aciensas temp late,the gene ofβ-1,3-1,4-glucanase(bgl)was amplified by PCR,which has about 750 bp in length.The gene was cloned into pTG19-T Easy vector,and the recombinant plasm id was identified by PCR,restriction enzyme analysis and sequencing.The homology analysis revealed that the nucleotide sequences of the clonedβ-1,3-1,4-glucanase gene sim ilar to the B.amyloliquef acines(M 15674),B.subtilis(D00518)andB.licheniform is(A Y365256)were 99%,95%and 94%,respectively.

Bacillus amyloliquef aciens,β-1,3-1,4-glucanase,cloning,sequence analysis

＊通信作者：呂文平(1968-),男,山西壽陽(yáng)人,工學(xué)博士,副教授,主要從事生物技術(shù)研究。Email:lwpkxy@163.com

Q 556.2

A

1673-1689(2011)04-0618-05

book=622,ebook=312

2010-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20090964);無(wú)錫市科技創(chuàng)業(yè)計(jì)劃(CIE00920)。

孫軍濤(1982-),男,河南漯河人,食品科學(xué)與工程博士研究生,主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與安全研究。Email:jtsfly@163.com