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    綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)

    2011-01-11 02:56:22羅燕趙宗勝谷新利邵永斌時敏
    關(guān)鍵詞:前體綿羊培養(yǎng)液

    羅燕,趙宗勝,谷新利,邵永斌,時敏

    (石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,石河子832003)

    肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat,IMF)是存在于肌外膜、肌束膜或肌內(nèi)膜上的脂肪,營養(yǎng)狀況好的家畜,其肌纖維膜的毛細(xì)血管上也有脂肪沉積。研究發(fā)現(xiàn),畜禽IMF含量、比例和分布狀況,與肌肉的多汁性、嫩度、肉色、大理石紋以及肌肉pH值等肉品評價(jià)指標(biāo)都有很強(qiáng)的相關(guān)性[1],是影響動物肉品質(zhì)和風(fēng)味的決定因素之一。近年來,如何在不影響動物生長、并保持整體脂肪率較低的情況下,適當(dāng)提高肌內(nèi)脂肪含量以提高肉品質(zhì),已經(jīng)成為當(dāng)前相關(guān)畜牧生產(chǎn)面臨的一個重要課題,而對于作為肌內(nèi)脂肪組織的基本單元——前體脂肪細(xì)胞的增值分化能力及其影響因素的研究,具有非常重要的意義。

    前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)不僅能完整地認(rèn)識脂肪組織發(fā)生和增生的全過程,并且可以直接觀察各種因素對這個過程的調(diào)控。目前,國內(nèi)已經(jīng)建立了豬[2-3]、牛[4-5]前體脂肪細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)模型,取材部位有皮下、肌內(nèi)和網(wǎng)膜脂肪組織等,但目前有關(guān)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立還未見報(bào)道。

    “君子文化不僅是傳統(tǒng)文化的一個重要制高點(diǎn),還是一個關(guān)鍵融匯點(diǎn)?!盵1]118-124 君子文化豐富博大,其內(nèi)蘊(yùn)前人學(xué)者多有闡發(fā),諸如仁義禮智信、忠孝節(jié)義等特質(zhì)早已納入并根植中華民族的文化心理與民族精神之中。 注杜是一種民族心理的體現(xiàn),這種民族心理外化表現(xiàn)出諸多形式,其核心正是儒家君子文化。 子曰:“質(zhì)勝文則野,文勝質(zhì)則史。 文質(zhì)彬彬,然后君子。”(《論語·雍也》)杜詩文質(zhì)兼?zhèn)?,不僅蘊(yùn)含著高超的文學(xué)藝術(shù)價(jià)值,也融匯了儒家傳統(tǒng)文化精髓。 君子文化在這一時期文人注杜中的表現(xiàn)方式大致可以梳理出以下幾個方面。

    本實(shí)驗(yàn)旨在摸索建立綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式,為后續(xù)通過反芻動物營養(yǎng)調(diào)控(如營養(yǎng)素等)手段調(diào)控肌內(nèi)脂肪的發(fā)育、肌內(nèi)脂肪沉積機(jī)制的研究提供一種簡便有效的細(xì)胞模型,旨在為今后改善本地綿羊肌內(nèi)脂肪含量、改善羊肉品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 組織來源

    將密度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液等量接種至24孔培養(yǎng)板中,隨機(jī)分為10組,每組3孔。完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞接觸抑制,換用分化培養(yǎng)液(記作第0天),之后每天取出3孔細(xì)胞測定脂肪含量,直至第10天結(jié)束。測定時棄去培養(yǎng)液,PBS涮洗2次,10%中性甲醛溶液固定30min,蒸餾水漂洗2次,油紅O工作液浸染2h,蒸餾水漂洗數(shù)次,烘干水分后加入1mL異丙醇進(jìn)行萃取,吸出萃取液,于722型分光光度計(jì)510nm處測定吸光度。

    1.1.2 主要試劑配置和儀器

    1.2.4.2 前體脂肪細(xì)胞的油紅O染色法鑒定

    1.2 方法

    1.2.1 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)[4]

    例2:...there was laughter fromunheard jokes,and lighted cig-arettesmade unintelligible circles inside.

    1.2.1.1 組織塊培養(yǎng)法

    1.2.4.3 前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量測定

    1.2.1.2 單層細(xì)胞培養(yǎng)法

    4K指分辨率達(dá)到3840×2160,8K指分辨率達(dá)到7680×4320。以往舊型號電視機(jī)多以720P高清(1280×720)分辨率為標(biāo)準(zhǔn),其后1080P全高清(1920×1080)盛行。

    取材及洗滌同組織塊培養(yǎng)法;將0.5~1.0mm3的組織小塊移入離心管中,含雙抗的PBS漂洗數(shù)次,加入5倍體積的1mg/mLⅠ型膠原酶消化液,密封管口,置于37℃恒溫水浴箱中消化1h(每隔3 min搖動1次);加入完全培養(yǎng)基終止消化,不銹鋼細(xì)胞篩過濾,收集濾液于另一離心管中,1000r/min,8min;細(xì)胞沉淀經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液漂洗2次,完全培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液;計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×105個/mL,接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),24h后換液以除去血細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞,之后每隔2~3d換液1次。

    1.2.2 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)[5]

    目前包括3G/4G/5G在內(nèi)的陸上移動通信技術(shù)應(yīng)用廣泛。3G的通信速率一般約為2 Mbit/s,而4G/5G的傳輸速率更優(yōu)于3G技術(shù)。如果3G/4G/5G移動通信技術(shù)能夠在近岸條件下的船岸通信中得以應(yīng)用,將極大地提高數(shù)據(jù)傳輸速率,使近岸船舶獲得實(shí)時航行安全信息成為可能。

    原代細(xì)胞培養(yǎng)至80%~90%匯合時,棄去培養(yǎng)液,PBS涮洗2遍,0.25%胰蛋白酶消化液在37℃下消化2~3min,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)回縮并有個別細(xì)胞飄起時,棄去消化液,加入完全培養(yǎng)液終止消化,吹打成細(xì)胞懸液,按1∶3或1∶4的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng),標(biāo)記為P1(第1代)。傳代培養(yǎng)過程中,每2~3d換1次完全培養(yǎng)液,直至細(xì)胞匯合并鋪滿整個培養(yǎng)皿后,再重復(fù)上述操作繼續(xù)傳代。

    四個人面面相覷。上官星雨捏著玉玦,將頭伸進(jìn)缺口。缺口之下,三五尺之深,水面如鏡,映照出花容月貌的女孩兒自己。對,那就是她,跟之前在黃河岸邊看到的一臉泥炭的乞丐不同,她的剪剪秋水,漆黑頭發(fā),海棠般的臉,明亮俏麗,這花瓣雨的洗濯,又讓她回到上官家小姐的樣子。

    原代細(xì)胞培養(yǎng)至80%~90%匯合時,經(jīng)胰蛋白酶消化、洗滌后收集細(xì)胞,按每孔5.0×104個細(xì)胞等量接種至2個24孔培養(yǎng)板內(nèi),隨機(jī)分為10組,每組3孔。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),記作第0天,以后每天取3孔細(xì)胞消化,每孔計(jì)數(shù)3次,結(jié)果以3孔的細(xì)胞均數(shù)表示,如此至第10組結(jié)束。

    1.2.4 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與初步鑒定[7]

    將密度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液等量接種至事先鋪有無菌蓋玻片的培養(yǎng)皿中,完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞接觸抑制,換用分化培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化(記作第0天),之后每2d換液1次,直至第10天。

    1.2.4.1 前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

    由表4可以看出,施用腐殖酸螯合肥后單果重、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑及可溶性固形物都有明顯增加,處理1較處理2單果重增加了5 g、果實(shí)橫徑增加了0.7 cm、果實(shí)縱徑增加0.9 cm、可溶性固形物增加2.1%;處理1較處理3單果重增加了12 g、果實(shí)橫徑增加了0.6 cm、果實(shí)縱徑增加1.3 cm、可溶性固形物增加1.4%。

    基礎(chǔ)培養(yǎng)基:DMEM/F12培養(yǎng)粉1袋(GIBCO,12500-062),2.438g NaHCO3,滅菌超純水定容至1000mL。完全培養(yǎng)基:90mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,10 mL胎牛血清(GIBCO,743794),青、鏈霉素終濃度均為100U/mL。分化培養(yǎng)基:完全培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為10μg/mL 胰島素(INS,Sigma,I5500),1.0μmol/L 地塞米松(DEX,Sigma,D1756),0.5 mmol/L 3-異 丁 基-1-甲 基 黃 嘌 呤 (IBMX,Sigma,17018)。1mg/mLⅠ型膠原酶消化液:25mgⅠ型膠原酶(Sigma,C0130),0.25g牛血清白蛋白,25 mL PBS溶解。0.25%胰蛋白酶消化液:0.25g胰蛋白酶(Sigma,1∶250)溶于100mL PBS中。上述溶液均需調(diào)整pH值至7.2~7.4,0.22μm微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝后置于-20℃保存。油紅O工作液:0.7g油紅O,溶于200mL異丙醇中,室溫靜置過夜,分析濾紙過濾,濾液加入150mL滅菌蒸餾水,4℃靜置過夜,過濾2次后室溫儲存。DKZ-2型恒溫水浴箱(上海精安實(shí)驗(yàn)儀器廠);FORMA3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司);LeicaDMI3000M型倒置顯微鏡(浙江省科學(xué)器材進(jìn)出口有限責(zé)任公司);722型分光光度計(jì)(上海市光棱技術(shù)有限公司)。

    紅軍在進(jìn)入川西北地區(qū)之初,就這樣爭取少數(shù)民族的支持并使之投身革命斗爭,從封建壓迫下解放出來的問題,進(jìn)行了仔細(xì)的研究,顯示出中央對這一問題的極大關(guān)注,意識到了群眾工作的重要性。

    取出上述爬滿細(xì)胞的蓋玻片,PBS漂洗2次,10%中性甲醛固定30min,蒸餾水漂洗2次,油紅O浸染2h,蒸餾水漂洗數(shù)次,蘇木精復(fù)染5min,自來水沖洗,干燥,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察脂滴著色情況。

    1.2.3 細(xì)胞生長曲線的測定[6]

    脂肪組織用PBS(含青霉素、鏈霉素各400U/mL)漂洗5次,仔細(xì)剔除血管和結(jié)締組織,剪成0.5~1.0mm3的小塊,置于無菌培養(yǎng)皿中,加入少量完全培養(yǎng)液懸浮組織小塊;用吸管分次吸取組織塊,將其均勻貼附于培養(yǎng)皿底壁上,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中約4h,待組織塊牢固粘附于培養(yǎng)皿底壁后,加適量完全培養(yǎng)液浸泡組織塊,靜置培養(yǎng)3d;3 d后補(bǔ)加或更換培養(yǎng)液,并吸出漂浮的組織塊;之后每隔2d換液1次。

    于石河子市活畜屠宰場選取健康綿羊1只,快速無菌分離肌內(nèi)脂肪組織,放入預(yù)先備好的含雙抗(青、鏈霉素各400U/mL)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,帶回實(shí)驗(yàn)室。

    2 結(jié)果

    2.1 形態(tài)學(xué)觀察

    2.1.1 組織塊培養(yǎng)法

    組織塊經(jīng)貼壁培養(yǎng)4~5d后,其邊緣可見游離出少量梭形或不規(guī)則形的成纖維樣細(xì)胞(圖1a)。8~9d后有多量細(xì)胞開始貼壁生長(圖1b)。14~15d可形成單層匯合,細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀或漩渦狀生長;隨著細(xì)胞密度增加,有少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等的微小脂滴(圖1c中箭頭所指)。當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大時,甚至出現(xiàn)重疊生長,細(xì)胞因營養(yǎng)和代謝物等因素,出現(xiàn)生長抑制,少量細(xì)胞開始脫落。

    《支持計(jì)劃》圍繞鄉(xiāng)村教師“下不去、留不住、教不好”三個核心問題,從鄉(xiāng)村教師師德水平、補(bǔ)充渠道、生活待遇、編制標(biāo)準(zhǔn)、職稱評聘、交流制度、能力素質(zhì)和榮譽(yù)制度等八個方面開始全方位、立體化地解決鄉(xiāng)村教師隊(duì)伍建設(shè)中面臨的突出問題?;诖耍ㄟ^對2 888名鄉(xiāng)村教師開展研究分析,以期從《支持計(jì)劃》的八大方面進(jìn)行深入探析鄉(xiāng)村教師生存狀態(tài)。

    圖1 組織塊法培養(yǎng)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞(200×)Fig.1Culture of ovine intramuscular preadipocyte by means of explant techniques(200×)

    2.1.2 單層細(xì)胞培養(yǎng)法

    經(jīng)I型膠原酶消化獲取的脂肪細(xì)胞,剛接種時細(xì)胞質(zhì)回縮,為小圓球形,呈懸浮狀態(tài)(圖2a);2~3 h后,有少量細(xì)胞貼壁呈小三角形(圖2b);24h后多數(shù)細(xì)胞貼壁,貼壁細(xì)胞伸展變形,呈長梭形或星形;第3天起,細(xì)胞生長加速,梭形和不規(guī)則形細(xì)胞大量增加(圖2c);至第7天,細(xì)胞可形成單層匯合,可進(jìn)行傳代。形成單層匯合后,亦有少數(shù)細(xì)胞自發(fā)分化,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)反光小滴。

    圖2 單層細(xì)胞法培養(yǎng)綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞(200×)Fig.2Culture of ovine intramuscular preadipocyte by means of monolayer culture method(200×)

    2.2 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

    細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時,需在顯微鏡下時刻觀察細(xì)胞形態(tài)變化,待大量細(xì)胞形態(tài)回縮變圓、個別細(xì)胞飄起時(圖3),應(yīng)立即終止消化,以免消化太過,對細(xì)胞造成損傷。第1次傳代(接種細(xì)胞密度1.0×105個/mL)后,前脂肪細(xì)胞仍為梭形,均勻分散分布于整個培養(yǎng)瓶底部,其形態(tài)、大小一致,增殖迅速。一般2~3d即可形成單層匯合,細(xì)胞的形態(tài)及其生長情況、脂肪積聚情況基本與原代培養(yǎng)一致。

    圖3 細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化時的形態(tài)變化Fig.3Morphology of cells digested by trypsin

    2.3 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的生長曲線測定

    在接種密度為5×104個/mL條件下,以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),繪制出細(xì)胞生長曲線。根據(jù)司徒鎮(zhèn)強(qiáng)等[6]關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞倍增時間的計(jì)算公式,得出綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的倍增時間為62h(圖4)。從圖4可以看出,綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長曲線類似S型,符合體外培養(yǎng)細(xì)胞的正常生長增殖規(guī)律,即先進(jìn)入緩慢生長的潛伏期(約38h),隨后到指數(shù)生長期(第2~6天),最后達(dá)到生長停止的平臺期(第7天后)。第9天,因細(xì)胞密度過大,受營養(yǎng)物質(zhì)競爭和代謝產(chǎn)物干擾,少數(shù)細(xì)胞脫落死亡。

    圖4 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長曲線Fig.4Gowth curve of intramuscular preadipocytes cultured in vitro

    2.4 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及油紅O染色鑒定

    細(xì)胞增殖與細(xì)胞分化是相互制約的2個過程,前體脂肪細(xì)胞在未使用誘導(dǎo)劑前,以增殖為主,而經(jīng)INS+DEX+I(xiàn)BMX誘導(dǎo)后快速進(jìn)入分化成熟階段。實(shí)驗(yàn)中,誘導(dǎo)分化第2天,有少量細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等散在的小脂滴;第4天,多脂滴細(xì)胞明顯增多(圖5a);第8~10天,部分小脂滴開始匯合成大脂滴(圖5b)。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞,經(jīng)油紅O染色法鑒定,脂滴被親脂的油紅O著色而成橘紅色,細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色,證明該細(xì)胞是脂肪細(xì)胞(圖5c)。

    圖5 脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及分化鑒定(200×)Fig.5Induce differentiation and identification of intramuscular preadipocyte

    2.5 前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量測定

    測定結(jié)果見圖6。

    由圖6可知,前體脂肪細(xì)胞經(jīng)INS+DEX+I(xiàn)BMX誘導(dǎo)分化后,于第2天少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)散在脂滴;第4天開始,隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行,細(xì)胞內(nèi)脂肪含量持續(xù)增加;脂肪含量的測定結(jié)果與誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂肪形成的形態(tài)學(xué)變化完全吻合。

    圖6 前體脂肪細(xì)胞分化過程中細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的變化Fig.6Cytoplasmic fat content changes in preadipocyte differentiation

    3 討論

    1)本研究采用組織塊法和Ⅰ型膠原酶消化法均獲得了成分均一、增殖和分化旺盛的梭形細(xì)胞。通過比較,發(fā)現(xiàn)2種方法各有優(yōu)缺點(diǎn):組織塊培養(yǎng)法操作步驟簡便、成功率高且細(xì)胞同源性好,缺點(diǎn)在于原代培養(yǎng)耗時較長(約15d),得到的細(xì)胞數(shù)量較少;而I型膠原酶消化法只需5~6d即可達(dá)到80%匯合,適于短期內(nèi)獲得大量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn),其缺點(diǎn)在于有其他種類細(xì)胞混雜,污染率較高,但通過嚴(yán)格控制操作可減少污染,通過細(xì)胞傳代可純化細(xì)胞。故本實(shí)驗(yàn)后續(xù)培養(yǎng)均采用消化法培養(yǎng),培養(yǎng)條件與豬[3]、牛[4]、人[8]、大鼠[9]等的前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)條件基本一致。另有文獻(xiàn)[10]指出,隨著不斷傳代及細(xì)胞生存環(huán)境的變化,細(xì)胞的生物學(xué)特性會發(fā)生改變,增殖和分化能力會不斷下降,故本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究均采用2代以內(nèi)的前體脂肪細(xì)胞。

    結(jié)合表5、表6可知堿劑在25 g/L質(zhì)量濃度是最好的,在堿劑質(zhì)量濃度25 g/L的情況下,再確定棉條的最佳染色溫度。染色溫度對染料的吸附有影響,一般染色溫度低,染色時間更長,可以提高棉條的染色深度。然而在實(shí)際染色中要考慮經(jīng)濟(jì)性,所以有必要設(shè)定合理的染色溫度。本實(shí)驗(yàn)通過改變?nèi)旧珳囟?,研究不同染色溫?(40℃,50℃,60℃,70℃,80℃)對棉條染色深度的影響。染色工藝見表7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

    2)細(xì)胞生長曲線是細(xì)胞生長基本規(guī)律的重要表現(xiàn),每一代細(xì)胞的生長過程可分為潛伏期、指數(shù)生長期、平臺期和抑制期。需要注意的是,潛伏期的長短與接種的細(xì)胞密度有關(guān),細(xì)胞數(shù)過少會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢;而細(xì)胞密度越大,潛伏期就越短,更導(dǎo)致細(xì)胞提早進(jìn)入生長抑制階段。本實(shí)驗(yàn)通過不斷摸索,認(rèn)為24孔板每孔接種5.0×104個細(xì)胞、接種后24h進(jìn)行首次換液能得到較好的結(jié)果。細(xì)胞經(jīng)歷38h的潛伏期后,于第2天開始迅速增殖,第7天時增殖速度逐漸下降進(jìn)入平臺期,第9天由于細(xì)胞密度增大,代謝產(chǎn)物增加,部分細(xì)胞脫落死亡,進(jìn)入抑制期,其生長曲線近似S型,符合細(xì)胞的正常生長增殖規(guī)律。

    3)本實(shí)驗(yàn)中的脂肪組織來源于成年雌性綿羊的肌肉內(nèi),分離得到的前體脂肪細(xì)胞在胰島素和地塞米松的誘導(dǎo)下能分化為成熟脂肪細(xì)胞,說明在成年動物中確實(shí)存在具有分化能力的前體脂肪細(xì)胞,這與Yagi等[11]的結(jié)果相一致等。原代培養(yǎng)中,在不外加胰島素和地塞米松的情況下,發(fā)現(xiàn)少部分細(xì)胞能自動分化為成熟脂肪細(xì)胞,而在傳代培養(yǎng)中則必須有胰島素和地塞米松的誘導(dǎo)。這可能是因?yàn)楸狙芯恐械闹緣K來源于成年個體的成熟脂肪組織,前脂肪細(xì)胞在體內(nèi)已經(jīng)被激活,或是本身分離獲得的前脂肪細(xì)胞中就存在一定數(shù)量的成熟脂肪細(xì)胞,故可觀察到這種活躍的脂肪細(xì)胞新生。

    在當(dāng)前時代背景下,各行各業(yè)的發(fā)展都離不開制度的規(guī)范,我國土木工程行業(yè)也不例外,對于土木工程施工管理工作,施工管理制度可以為土木工程項(xiàng)目的整體施工質(zhì)量管理工作提供基礎(chǔ)保障,因此,只有在健全的管理制度下,才能保證管理工作的順利進(jìn)行。但就我國目前土木工程施工管理工作的實(shí)際情況,大部分施工單位都在應(yīng)用傳統(tǒng)的管理制度以及管理規(guī)范,由于這些管理制度的落后,無法滿足當(dāng)前管理工作的實(shí)際需要,且內(nèi)容不夠全面,對工程管理工作中的一些細(xì)節(jié)無法進(jìn)行系統(tǒng)管理,對現(xiàn)場施工工作的順利進(jìn)行起到了阻礙作用。

    4)油紅O是一種能與細(xì)胞內(nèi)甘油三酯特異性結(jié)合而使其著橘紅色的染料,其準(zhǔn)確性和敏感性與測定前脂肪細(xì)胞分化過程中的標(biāo)志酶GPDH相似,因此常用作體外培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞的鑒定、分化狀態(tài)的觀察和分化程度的定量分析[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,原代培養(yǎng)細(xì)胞在80%匯合后、傳代細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后,胞漿內(nèi)逐漸出現(xiàn)反光小滴,經(jīng)油紅O染色后呈紅色,證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。而且,細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后開始有脂肪積聚,4d后積聚量迅速增加,與誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂肪形成的形態(tài)學(xué)變化完全吻合。

    綜上所述,通過一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和研究分析證明,本研究成功建立了綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式,探索了其生長、增殖及分化的生物學(xué)特征,可為后續(xù)開展綿羊肌內(nèi)脂肪發(fā)育與沉積機(jī)制及改善羊肉品質(zhì)和風(fēng)味等研究奠定基礎(chǔ)。

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