化學(xué)誘導(dǎo)劑與玉米花粉誘導(dǎo)小黑麥單倍體的技術(shù)

王雪玉，魏凌基，殷穩(wěn)娜，聶石輝，楊玉玲，孔廣超

（石河子大學(xué)麥類作物研究所，石河子832003）

小黑麥?zhǔn)怯尚←満秃邴溄?jīng)屬間人工雜交及染色體加倍培育而成的一個(gè)新物種，不僅具有小麥籽粒高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)，同時(shí)又繼承了黑麥生物產(chǎn)量高、耐逆性強(qiáng)的特性。目前，小黑麥已成為了一種重要糧食與飼草等多種用途的作物［1］。

孤雌生殖與花藥培養(yǎng)均屬于單倍體育種的方式，是育種過程中加速世代穩(wěn)定的重要途徑之一［2－4］。自1964年人們經(jīng)過花藥離體培養(yǎng)獲得單倍體后，應(yīng)用單倍體技術(shù)進(jìn)行的品種改良進(jìn)入了迅速發(fā)展的時(shí)期。但對(duì)于普通小麥而言，這種產(chǎn)生單倍體的方法，不僅成苗率低，而且會(huì)產(chǎn)生大量的白化苗。1975年Barely利用普通小麥與球莖大麥雜交獲得了高頻率的小麥單倍體［5］，Zenkteler［6］最早報(bào)道了六倍體普通小麥與玉米之間的遠(yuǎn)緣雜交，隨后Laurie［7］證明了小麥與玉米雜交后，在最初的3次細(xì)胞分裂中，來(lái)自父本玉米的染色體被完全排除，從而形成了僅有21條母本小麥染色體的單倍體胚。

自1984年Zenkteler等首次開展了小麥與玉米遠(yuǎn)緣雜交獲得小麥單倍體以來(lái)［8］，國(guó)內(nèi)外開展小麥與玉米雜交研究的報(bào)道較多［9～16］，但在利用玉米花粉刺激小黑麥雌蕊以獲得六倍體小黑麥單倍體方面還鮮有研究［17］。然而利用玉米花粉誘導(dǎo)小黑麥單倍體時(shí)因玉米開花期與小麥、小黑麥開花期等難以相遇，給玉米花粉誘導(dǎo)小黑麥單倍體帶來(lái)了技術(shù)障礙［18－19］。

本研究擬開展利用化學(xué)藥劑單獨(dú)使用與化學(xué)藥劑結(jié)合玉米花粉來(lái)誘導(dǎo)小黑麥孤雌生殖以形成的六倍體小黑麥單倍體進(jìn)行初步研究，旨在為加速小黑麥育種進(jìn)程、縮短育種年限、提高雜交育種效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

試驗(yàn)所用六倍體小黑麥材料均為石河子大學(xué)麥類研究所培育的冬性小黑麥雜交組合F1。玉米品種為普通玉米早熟品種農(nóng)家種哈密六十黃。

1．2 方法

1．2．1 試驗(yàn)材料的種植

2008年9月將供試的冬性六倍體小黑麥播種于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站，采用人工點(diǎn)播，株距5 cm，行距20cm。

為確保玉米與小黑麥開花期相遇，將所用玉米品種分別于2009年3月9日、16日、23日分三期播于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院育種家種子庫(kù)溫室，以實(shí)現(xiàn)玉米花粉散粉期和六倍體小黑麥的開花期相遇。

1．2．2 試驗(yàn)材料的處理

1）化學(xué)藥劑處理。在小黑開花期，先采用常規(guī)去雄方法，對(duì)即將開花授粉的穗子進(jìn)行整穗、剪穎、去雄、套袋。次日采用小花滴注法利用化學(xué)誘導(dǎo)劑（二甲基亞砜40mL／L，秋水仙素4g／L，肌醇100 mg／L，吲哚乙酸20mg／L和2，4－D 20mg／L）［17］處理已去雄麥穗。處理后套袋、掛牌，標(biāo)明處理日期。48h后再用同樣化學(xué)藥劑重復(fù)滴注1次。共處理15個(gè)F1組合，每個(gè)組合處理5穗。

2）玉米花粉與化學(xué)藥劑的復(fù)合處理。按前述方法對(duì)未開花授粉的六倍體小黑麥進(jìn)行去雄、套袋。在去雄后的次日，采集新鮮玉米花粉用毛筆蘸花粉涂抹于去雄小花上，以進(jìn)行授粉雜交，而后進(jìn)行套袋，掛牌，標(biāo)明處理日期。第2天同一時(shí)間用上述化學(xué)藥劑再滴注1次。處理的六倍體小黑麥F1組合及每組合的穗數(shù)均同化學(xué)誘導(dǎo)方法。

1．2．3 胚拯救

經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)劑以及化學(xué)誘導(dǎo)劑與玉米花粉復(fù)合處理后得到的單倍體胚大部分都不具有胚乳，因此必須采取培養(yǎng)基培養(yǎng)等方法對(duì)其進(jìn)行胚拯救。

兩種方法處理后的第16天分別采集上述兩種方法誘導(dǎo)過的六倍體小黑麥麥穗，帶回實(shí)驗(yàn)室，剝離出已膨大的子房，統(tǒng)計(jì)穎果數(shù)。并將其用質(zhì)量濃度為0．1%升汞溶液滅菌6～8min，用無(wú)菌水充分沖洗3次。在超凈工作臺(tái)上，借助于立體解剖鏡剝出幼胚，統(tǒng)計(jì)單倍體胚數(shù)，并將其分別接種于1／2MS培養(yǎng)基和B5改良培養(yǎng)基（B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加30%蔗糖）上。將幼胚在25℃下暗培養(yǎng)1周后，再移入25℃光照培養(yǎng)下至長(zhǎng)成幼苗。分別按以下方法計(jì)算穎果率、得胚率、萌發(fā)率及成苗率。

穎果率（%）＝（各處理穎果數(shù)／各處理授粉小花數(shù)）×100%；

穎果得胚率（%）＝（各處理穎果得胚數(shù)／各處理穎果數(shù)）×100%；

得胚率（%）＝（各處理所得單倍體胚數(shù)／各處理授粉小花數(shù)）×100%；

萌發(fā)率（%）＝（各處理接種單倍體幼胚數(shù)／萌發(fā)胚數(shù)）×100%；

成苗率（%）＝（各處理成苗數(shù)／各處理接種單倍體幼胚數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2．1 誘導(dǎo)方式對(duì)小黑麥單倍體胚形成效率的影響

化學(xué)誘導(dǎo)劑與玉米花粉結(jié)合化學(xué)誘導(dǎo)劑復(fù)合誘導(dǎo)冬性小黑麥后，其單倍體得胚率見表1。

由表1可見，經(jīng)化學(xué)藥劑單獨(dú)處理的小花總數(shù)為3120個(gè)，其穎果率為5．90%，穎果得胚率為7．03%，總的得胚率為5．89%。經(jīng)玉米花粉與化學(xué)藥劑復(fù)合誘導(dǎo)共處理的小花數(shù)為2545個(gè)，其穎果率為12．84%，穎果得胚率為10．12%，總得胚率為12．90%。這說(shuō)明經(jīng)花粉與化學(xué)藥劑復(fù)合處理誘導(dǎo)六倍體冬性小黑麥單倍體較化學(xué)藥劑單獨(dú)處理的效果好。

表1 兩種誘導(dǎo)方式下六倍體小黑麥單倍體胚形成率Tab．1Effect of different produced methods on haploid embryo formation of wheat

結(jié)果見表2。由表2可見，化學(xué)誘導(dǎo)劑所處理的15個(gè)六倍體冬性小黑麥組合中，其穎果率為0～30．45%，平均為5．89%，可見不同組合的六倍體小黑麥經(jīng)化學(xué)藥劑誘導(dǎo)后的穎果率存在明顯差異，即不同基因型在化學(xué)藥劑誘導(dǎo)下其穎果的形成能力存在差異，其中誘導(dǎo)穎果率最高的組合是 WH08－7／07H519－520，可作為良好的單倍體胚誘導(dǎo)源。而在玉米花粉與化學(xué)藥劑復(fù)合誘導(dǎo)的15個(gè)冬性六倍體小黑麥組合中，其穎果率為0%～39．80%，平均為12．84%，其中穎果率最高的組合為 07H261－62／NTH2146－2?？梢娪衩谆ǚ叟c化學(xué)藥劑復(fù)合處理對(duì)不同六倍體小黑麥組合的穎果率具有明顯的差異，同時(shí)玉米花粉與化學(xué)誘導(dǎo)劑復(fù)合誘導(dǎo)的穎果率總體上略高于單一的化學(xué)誘導(dǎo)劑的穎果率。

表2 兩種處理方式下的六倍體冬性小黑麥穎果率 %Tab．2Frequencies of caryopsidsis of hexaploid winter Triticale induced by chemiclas vs maize pollen and chemicals

所處理的15個(gè)組合中有11個(gè)組合在玉米花粉和化學(xué)藥劑的復(fù)合誘導(dǎo)下其穎果率有所提高。從兩種誘導(dǎo)方式下的最高穎果率和15個(gè)小黑麥組合的平均穎果率來(lái)看，玉米花粉與化學(xué)藥劑的復(fù)合處理的最高值和平均值均較化學(xué)藥劑較高。但對(duì)兩種誘導(dǎo)方式下的穎果率進(jìn)行成對(duì)數(shù)據(jù)的平均值分析表明，穎果率間的差異未達(dá)到顯著差異（t＝2．14，P＝0．145），但玉米花粉與化學(xué)藥劑復(fù)合作用誘導(dǎo)的穎果率的變幅、平均值和方差均大于化學(xué)藥劑單一誘導(dǎo)作用。

2．2 不同小黑麥組合對(duì)穎果率的影響

結(jié)果見表3。由表3可見，經(jīng)玉米花粉與化學(xué)藥劑復(fù)合處理的15個(gè)小黑麥組合中，穎果率最高的組合 07H261－62／NTH2146－2 與 最 低 組 合 WH08鑒2／07H255－56的穎果率相差39．80%，差異達(dá)極顯著水平，這說(shuō)明不同小黑麥基因型在誘導(dǎo)單倍體性能上具有顯著差異。

表3 不同小黑麥組合與玉米雜交的穎果率Tab．3Frequencies of caryopsidsis in different Triticale×maize crosses

2．3 培養(yǎng)基對(duì)六倍體冬性小黑麥幼胚成苗率的影響

由于經(jīng)玉米花粉或化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)形成的幼胚缺乏胚乳，在發(fā)育過程中會(huì)夭亡，因此需對(duì)其幼胚進(jìn)行拯救培養(yǎng)。將上述兩種誘導(dǎo)方式下所誘導(dǎo)出的幼胚剝離出來(lái)，分別接種于1／2MS培養(yǎng)基和改良B5培養(yǎng)基上進(jìn)行胚拯救，不同小黑麥組合在這兩種培養(yǎng)基上的幼胚成苗率也存在不同程度的差異，各組合的幼胚成苗率見表4。

由表4可見，經(jīng)1／2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的幼胚成苗率為0～100%，組合間的成苗率方差為926．05，平均為25．16%，其中有3個(gè)組合幼胚未誘導(dǎo)成苗，組合 WH08鑒2／07H255－56的幼胚 成 苗 率 為100%，可見不同基因型其幼胚成苗率之間具有較大差異。在改良B5培養(yǎng)基上進(jìn)行胚拯救中，共有4個(gè)組合未拯救出幼苗，而幼胚成苗率最高組合為WH08鑒2／NSDW57－3，其幼胚成苗率為94．28%，15個(gè)組合的平均幼胚成苗率為31．41%。組合間的幼胚成苗率方差為933．79。從其15個(gè)組合的平均幼胚成苗率來(lái)看，經(jīng)改良B5培養(yǎng)基拯救的幼胚成苗率要略高于MS培養(yǎng)基，但經(jīng)成對(duì)數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)分析表明，兩種培養(yǎng)基在幼胚拯救中對(duì)其成苗率的影響未發(fā)現(xiàn)存在顯著差異（t＝2．14，P＝0．49）。

表4 兩種培養(yǎng)基下的六倍體冬性小黑麥幼胚成苗率 %Tab．4Seedling rate of hexaploid winter triticale on two mediums types

3 討論與結(jié)論

1）本試驗(yàn)結(jié)果表明，六倍體冬性小黑麥不同組合在化學(xué)誘導(dǎo)劑及玉米花粉和化學(xué)誘導(dǎo)劑復(fù)合誘導(dǎo)下，其形成單倍體胚的能力有所不同，其穎果率分別為0%～30．45%和0%～39．8%，可見基因型效應(yīng)對(duì)六倍體冬性小黑麥穎果率具有明顯差異。同時(shí)不同組合在兩種胚拯救培養(yǎng)基上的幼胚成苗率也具有有明顯差異，15個(gè)組合的單倍體幼胚成苗率分別為0%～100．0%和0%～94．28%。這些均表明不同的六倍體小黑麥組合在接受化學(xué)誘導(dǎo)劑和玉米花粉與化學(xué)藥劑的復(fù)合誘導(dǎo)后形成單倍體胚的能力有明顯差異，同時(shí)不同組合的幼胚在拯救培養(yǎng)基上的成苗率也有差異。這與前人［20］在小麥方面的研究結(jié)論相似。這表明選擇具有較高單倍體胚誘導(dǎo)能力和較高單倍體胚成苗率的基因型是六倍體小黑麥單倍體形成及其單倍體育種技術(shù)的基礎(chǔ)。

2）在本研究所采用的兩種單倍體胚誘導(dǎo)方式中，盡管玉米花粉與化學(xué)誘導(dǎo)劑復(fù)合處理與單一化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)所檢測(cè)的15個(gè)冬性小黑麥組合的穎果率平均數(shù)間無(wú)顯著差異，但大部分組合在玉米花粉和化學(xué)誘導(dǎo)劑的復(fù)合誘導(dǎo)下其穎果率較高。這與在有關(guān)小麥報(bào)道［21］的玉米花粉與激素配合使用來(lái)誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體的效果較好的結(jié)論基本一致，但也有部分組合化學(xué)誘導(dǎo)劑處理的穎果率較玉米花粉和化學(xué)誘導(dǎo)劑復(fù)合處理的穎果率高，這可能是由于不同的基因型所致。這表明不同六倍體小黑麥組合在選擇較高穎果率時(shí)誘導(dǎo)方式的復(fù)雜性，需要針對(duì)不同雜交組合來(lái)選擇較優(yōu)的誘導(dǎo)方式。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，選用玉米花粉和化學(xué)誘導(dǎo)劑的復(fù)合誘導(dǎo)，必須調(diào)整玉米散粉期與小黑麥的開花期相遇，而不同的播種期和不同發(fā)育速度造成了這種花期調(diào)整的困難［22］，而相比之下，化學(xué)藥劑誘導(dǎo)不存在季節(jié)和花期不遇的限制，具有更方便的應(yīng)用價(jià)值。

3）本實(shí)驗(yàn)中，分別采用了改良B5培養(yǎng)基和1／2 MS培養(yǎng)基對(duì)獲得的單倍體幼胚進(jìn)行拯救。在這兩種胚拯救培養(yǎng)基上，各組合的幼胚成苗率存在明顯差異，盡管在兩種培養(yǎng)基間15個(gè)組合的幼胚成苗率平均值略有差異，但未檢測(cè)到顯著的差異。相同組合在兩種培養(yǎng)基上的幼胚成苗率間的變化也無(wú)統(tǒng)一規(guī)律。這些均反映出了基因型與胚拯救培養(yǎng)基選擇的復(fù)雜性，應(yīng)針對(duì)每種基因型有針對(duì)性地選擇相應(yīng)的拯救培養(yǎng)基方可取得最優(yōu)的成苗率。

4）長(zhǎng)期以來(lái)，利用玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體的研究較多［7－13，17－18，20－22］。而作為小麥與黑麥人工遠(yuǎn)緣雜交和染色體加倍培育的新物種小黑麥，在自然情況下因其染色體來(lái)源不同，在常規(guī)育種中，分離嚴(yán)重，穩(wěn)定需要的世代數(shù)多，延緩了小黑麥常規(guī)育種的進(jìn)程。本研究初步比較了化學(xué)誘導(dǎo)劑和玉米花粉與化學(xué)誘導(dǎo)劑復(fù)合處理對(duì)不同組合六倍體冬性小黑麥單倍體胚的誘導(dǎo)和1／2MS和改良B5培養(yǎng)基對(duì)小黑麥單倍體胚幼苗成苗能力的影響，其結(jié)果將會(huì)對(duì)小黑麥孤雌生殖單倍體育種具有指導(dǎo)意義，進(jìn)而為更好的獲得DH（double haploid）群體，縮短育種年限，推動(dòng)小黑麥的育種進(jìn)程具有直接的指導(dǎo)意義。

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