姜黃素對長期攝入酒精和不同量蛋白質(zhì)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究Δ

周旭春（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶市 400016）

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，過高或過低蛋白質(zhì)攝入都將促進(jìn)腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，加速酒精性胰腺損傷的進(jìn)程[1]。姜黃素（Curcumin）是從姜黃中提取的一種多酚類色素，有廣泛的藥理作用。其在抗炎、腫瘤預(yù)防和治療上近年都備受關(guān)注[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用[3]，但其對酒精聯(lián)合過高、過低蛋白質(zhì)攝入造成的胰腺損傷的作用如何尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，筆者對其進(jìn)行研討，以期為姜黃素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CKX41型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；5810R型高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；M2e型多功能酶標(biāo)儀（重慶邁克科技公司）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；600型電子顯微鏡（日本Hitach公司）。

1.2 試藥

姜黃素（生工生物工程（上海）有限公司）；環(huán)氧化酶-2（COX-2）羊單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；TUNEL試劑盒（美國Roche公司）；淀粉酶檢測試劑盒（上?？迫A-東菱診斷用品有限公司）；脂肪酶檢測試劑盒（德國GmbH公司）。

1.3 動物

清潔級Wistar大鼠30只，♂，體重80～110 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）20070001）。

2 方法

2.1 復(fù)制模型

Wistar大鼠總熱量供給相同，脂肪含量占總熱量供給的25%，隨機(jī)分組如下：正常對照組，正常飼養(yǎng)；酒精組，以25%酒精代替飲水自由飲用，其中又隨機(jī)分為高蛋白（蛋白質(zhì)占總熱量供給的32%）、高蛋白+姜黃素（蛋白質(zhì)占總熱量供給的32%，ig姜黃素300 mg·kg-1）、低蛋白（蛋白質(zhì)占總熱量供給的6%）、低蛋白+姜黃素（蛋白質(zhì)占總熱量供給的6%，姜黃素300 mg·kg-1）組。

各組大鼠其他礦物質(zhì)和微量元素?cái)z入相當(dāng)，每組6只，分別喂給上述特種飼料6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死大鼠，稱重，取出胰腺組織。

2.2 光鏡下觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化

取少量胰腺組織固定于10%中性甲醛緩沖液中，HE染色，由專業(yè)病理醫(yī)師觀察切片。

2.3 電鏡下觀察胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

切取火柴頭大小的胰腺組織，2.5%戊二醛固定，制片后于電鏡下觀察胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

2.4 胰腺外分泌功能檢測

取部分胰腺組織制成組織勻漿，以3 000 r·min-1離心，取上清液，分別檢測每1 mL胰腺組織勻漿中的淀粉酶和脂肪酶含量。

2.5 大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL法）

取胰腺組織制成的石蠟切片，二甲苯脫蠟，微波爐修復(fù)抗原，蛋白酶K作用30 min，其余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。最后在光鏡下觀察，細(xì)胞核染色呈棕黃色，為凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)（AI）計(jì)算方法：在高倍視野（400×）下，選擇5個(gè)視野分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)（AI＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。

2.6 胰腺組織切片COX-2表達(dá)的檢測

取胰腺組織制成的石蠟切片，二甲苯脫蠟，微波爐修復(fù)抗原，0.3%H2O230 min去除內(nèi)過氧化酶，PBS洗滌，正常血清室溫封閉30 min，分別滴加工作濃度為1∶100的羊抗50 μL，細(xì)胞漿染成棕黃色為COX-2表達(dá)陽性。結(jié)果以圖像分析儀作積分光密度量化處理。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 體重的稱定

高蛋白、高蛋白+姜黃素、低蛋白、低蛋白+姜黃素、正常對照組大鼠體重分別為（260±25）、（275±30）、（250±23）、（263.5±19）、（253.5±15.0）g，各組間比較無顯著性差異。

3.2 病理形態(tài)學(xué)的改變

3.2.1 腺泡細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的改變 HE染色顯示，高、低蛋白組胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)可見脂肪空泡，腺泡細(xì)胞充血水腫；2組在加用姜黃素后，腺泡細(xì)胞充血水腫有所減輕。但各組胰腺組織顯微結(jié)構(gòu)無顯著性差異，故圖片略去。

3.2.2 腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變 各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞均有不同程度的損傷。高蛋白組大鼠的胰腺腺泡細(xì)胞線粒體普遍腫脹，體積增大，基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)亮區(qū)，基質(zhì)顆粒減少，嵴少，細(xì)胞內(nèi)脂滴增加，酶原顆粒減少，髓樣結(jié)構(gòu)形成。高蛋白+姜黃素組腺泡細(xì)胞內(nèi)腫脹線粒體數(shù)量減少，酶原顆粒增加，髓樣結(jié)構(gòu)減少。進(jìn)食高蛋白飼料的所有大鼠胰腺腺泡細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均無明顯改變。低蛋白組線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，可見髓樣結(jié)構(gòu)形成，部分細(xì)胞溶解壞死。低蛋白+姜黃素組線粒體腫脹減輕，髓樣結(jié)構(gòu)減少，未見細(xì)胞溶解壞死。胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變見圖1。

3.3 胰腺外分泌功能的改變

圖1 胰腺腺泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變（6 000×）A.高蛋白組；B.高蛋白+姜黃素組；C.低蛋白組；D.低蛋白+姜黃素組Fig 1Ultra-microstructure of pancreatic acinar cel（l6 000×）A.high protein group；B.high protein+curcumin group；C.low protein group；D.low protein+curcumin group

無論攝入高蛋白、低蛋白飼料，加用姜黃素后，胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶含量均較未用姜黃素時(shí)有所增加，其中高蛋白+姜黃素組胰腺組織勻漿淀粉酶和脂肪酶較高蛋白組顯著增加（P＜0.05），低蛋白+姜黃素組脂肪酶較低蛋白組顯著增加（P＜0.05）。大鼠胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶的改變見表1。

表1 大鼠胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶的改變（±s）Tab 1 Changes of lipase and amylase in pancreatic tissue homogenat（e±s）

表1 大鼠胰腺組織勻漿淀粉酶、脂肪酶的改變（±s）Tab 1 Changes of lipase and amylase in pancreatic tissue homogenat（e±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與高蛋白組比較：#P＜0.05；與低蛋白組比較：△P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.high protein group：#P＜0.05；vs.low protein group：△P＜0.05

脂肪酶/U·g-1 10 193.06±206.27 263.16±15.22＊798.43±28.68#111.67±8.87＊163.89±9.90△分組正常對照組高蛋白組高蛋白+姜黃素組低蛋白組低蛋白+姜黃素組淀粉酶/U·g-1 6 532.87±100.11 364.49±15.09＊423.31±20.66#91.67±6.53＊103.42±10.32△

3.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

與正常對照組比較，高、低蛋白組AI均顯著升高（P＜0.01）；與高蛋白組比較，高蛋白+姜黃素組AI顯著降低（P＜0.05）；與低蛋白組比較，低蛋白+姜黃素組AI顯著降低（P＜0.05）。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見表2。

3.5 COX-2檢測結(jié)果

經(jīng)圖像分析檢測得高蛋白組、高蛋白+姜黃素組、低蛋白組、低蛋白+姜黃素組光密度值分別為（0.13±0.03）、（0.08±0.02）、（0.22±0.03）、（0.14±0.06），表明加用姜黃素后，高、低蛋白組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞胞漿COX-2的棕黃染色均變淺。胰腺腺泡細(xì)胞COX-2的表達(dá)見圖2。

4 討論

表2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（±s）Tab 2 Results of detection of cell apoptosi（s±s）

表2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（±s）Tab 2 Results of detection of cell apoptosi（s±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與高蛋白組比較：#P＜0.05；與低蛋白組比較：△P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.high protein group：#P＜0.05；vs.low protein group：△P＜0.05

分組正常對照組高蛋白組高蛋白+姜黃素組低蛋白組低蛋白+姜黃素組AI/%0.31±0.1 2.1±0.1＊1.5±0.3#6.6±1.0＊4.3±0.5△

圖2 胰腺腺泡細(xì)胞COX-2的表達(dá)（200×）A.高蛋白組；B.高蛋白+姜黃素組；C.低蛋白組；D.低蛋白+姜黃素組Fig 2 Expression of COX-2 in pancreatic acinar cell（200×）A.high protein group；B.high protein+curcumin group；C.low protein group；D.low protein+curcumin group

慢性胰腺炎是以胰腺實(shí)質(zhì)發(fā)生慢性持續(xù)性炎性損害、纖維化和可能導(dǎo)致的胰管擴(kuò)張、胰管結(jié)石或鈣化等不可逆性的形態(tài)改變?yōu)槠涮卣?，可引起頑固性疼痛和永久性內(nèi)、外分泌功能丟失[4]的炎癥疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，酒精是慢性胰腺炎最主要的病因。但前人動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，長期飲酒并未造成典型的慢性胰腺炎的病理改變。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，長期飲酒僅造成大鼠胰腺的外分泌功能減退，但胰腺的顯微結(jié)構(gòu)卻無顯著性改變，胰腺腺泡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)可見髓樣結(jié)構(gòu)形成，呈慢性胰腺腺泡細(xì)胞退行性改變[5]。有研究認(rèn)為，慢性胰腺腺泡細(xì)胞退行性改變可能是酒精性慢性胰腺腺泡細(xì)胞損傷的早期改變。

本研究中，給大鼠喂飼姜黃素后，大鼠胰腺腺泡細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)雖無特別的變化，但無論高蛋白組還是低蛋白組其超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生了不同程度的改變，表現(xiàn)為線粒體腫脹減輕，髓樣結(jié)構(gòu)減少，胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡減少，胰腺組織的淀粉酶和脂肪酶的含量均較正常對照組有不同程度的升高，提示使用姜黃素后胰腺腺泡細(xì)胞的退行性改變有改善。

姜黃素是一種多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應(yīng)小。近年研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有某些非甾體類抗炎藥物的特性，可抑制COX-2的表達(dá)。COX-2是調(diào)節(jié)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，是炎癥性損傷的一個(gè)標(biāo)志物[6，7]。筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)酒精性胰腺損傷時(shí)COX-2的表達(dá)增加，其表達(dá)與胰腺腺泡細(xì)胞的損傷程度有關(guān)，胰腺腺泡細(xì)胞的損傷越輕，COX-2的表達(dá)越低[7]。慢性炎癥時(shí)COX-2的表達(dá)增加，抑癌基因失活，COX-2的表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)[8]。本研究中姜黃素對高、低蛋白組COX-2的表達(dá)均有不同程度的抑制。因此，筆者推測姜黃素可能通過抑制COX-2的表達(dá)，來減少胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，改善胰腺腺泡細(xì)胞退行性改變。

總之，本研究觀察了姜黃素對過高、過低蛋白質(zhì)聯(lián)合慢性酒精攝入所致的胰腺腺泡細(xì)胞退行性病變的影響，發(fā)現(xiàn)姜黃素可減輕胰腺腺泡細(xì)胞的退行性改變，此作用可能與抑制COX-2的表達(dá)有關(guān)。由于COX-2的表達(dá)與胰腺腺泡細(xì)胞的損傷和胰腺癌的發(fā)生有關(guān)，因此在酒精致胰腺腺泡細(xì)胞退行性改變、慢性胰腺炎的過程中，間歇使用姜黃素，對這一漫長過程的各個(gè)階段可能均有修復(fù)和減緩發(fā)展的作用，有利于預(yù)防和治療慢性胰腺炎、胰腺癌。

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