雞產(chǎn)蛋不同時(shí)期蛋殼元素組成及超微結(jié)構(gòu)的研究

孫杰，趙宗勝，趙海璇，李巖，姚秀娟

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

雞產(chǎn)蛋不同時(shí)期蛋殼元素組成及超微結(jié)構(gòu)的研究

孫杰，趙宗勝，趙海璇，李巖，姚秀娟

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

采用高分辨率的掃描電鏡和X射線能譜儀測定蛋雞產(chǎn)蛋不同時(shí)期蛋殼的元素組成和超微結(jié)構(gòu)，分析了其結(jié)構(gòu)模式，蛋殼從內(nèi)到外包括殼膜、錐體層、柱狀層、表面晶體層、覆蓋層五部分。結(jié)果表明：隨著蛋進(jìn)入子宮時(shí)間的延長，蛋殼厚度越來越大，蛋殼中鈣元素的含量越來越多，蛋殼強(qiáng)度的大小可能與鈣含量的多少、殼膜層的厚度、殼膜纖維的粗細(xì)、錐體層乳頭間的空隙大小以及覆蓋層上裂隙的深淺和數(shù)量有關(guān)。

雞；蛋殼；元素組成；超微結(jié)構(gòu)

蛋殼是禽蛋的一種天然包裝，其便于蛋的保存、運(yùn)輸，而且在蛋的孵化過程中，蛋殼可對(duì)胚胎起保護(hù)作用，為胚胎提供鈣質(zhì)，幫助胚胎骨骼鈣化。蛋殼質(zhì)量是禽蛋品質(zhì)的重要特性之一。禽蛋在收集、分級(jí)、包裝、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏和加工等環(huán)節(jié)中，因蛋殼破損所造成的損失率為6%～10%，加之肉眼不能識(shí)別的微小裂紋等給禽蛋業(yè)所造成的經(jīng)濟(jì)損失更為嚴(yán)重。據(jù)相關(guān)資料估計(jì)我國每年因蛋殼破損所造成的經(jīng)濟(jì)損失在5億元以上。蛋殼的質(zhì)量受多種因素影響，主要有遺傳、營養(yǎng)、疾病、年齡等。目前，改善蛋殼質(zhì)量的研究主要集中在飼養(yǎng)環(huán)境與營養(yǎng)供給控制方面等［1－2］。隨著現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)的發(fā)展與環(huán)境控制技術(shù)水平的提高，禽蛋生產(chǎn)業(yè)中單純因營養(yǎng)供給不足或失衡及環(huán)境控制不良導(dǎo)致的蛋殼質(zhì)量問題已不多見［3］，而高強(qiáng)度生產(chǎn)條件下蛋雞體內(nèi)蛋殼形成機(jī)制的差異可能是影響蛋殼質(zhì)量的關(guān)鍵，傳統(tǒng)蛋殼質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)包括蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋形指數(shù)等結(jié)構(gòu)屬性方面，而對(duì)物質(zhì)屬性方面研究比較少，元素組成和超微構(gòu)造是物質(zhì)屬性重要組成部分，對(duì)蛋殼質(zhì)量有必然的影響。因此，開展蛋殼物質(zhì)屬性的研究對(duì)減少經(jīng)濟(jì)損失，探索蛋殼質(zhì)量改善調(diào)節(jié)機(jī)制有重要意義。

近年的研究表明，蛋殼沉積形成機(jī)制的差異是影響蛋殼質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一［4－5］，而研究蛋殼的超微構(gòu)造可進(jìn)一步揭示蛋殼形成機(jī)制差異。本文將產(chǎn)蛋不同時(shí)期的蛋殼在X射線能譜儀、環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察所得物質(zhì)結(jié)構(gòu)屬性和超微結(jié)構(gòu)屬性結(jié)果進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探尋蛋殼結(jié)構(gòu)對(duì)蛋殼質(zhì)量的影響，了解蛋殼形成的過程及其受控因素，從而提高蛋殼質(zhì)量的深入研究奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取30只12月齡的健康羅曼蛋雞，觀察每只雞的產(chǎn)蛋時(shí)間和數(shù)量［18－19］，連續(xù)觀察30d；掌握每只雞的產(chǎn)蛋規(guī)律，根據(jù)蛋在輸卵管各個(gè)部位的停留時(shí)間，分別在蛋進(jìn)入子宮前2h、蛋進(jìn)入子宮前1h、蛋進(jìn)入子宮后5h、蛋進(jìn)入子宮后15h和成熟期（自然產(chǎn)出的蛋）收集蛋殼，每個(gè)時(shí)間段取3個(gè)蛋殼。

1.2 方法

1.2.1 蛋殼的采集

分別在蛋進(jìn)入子宮前2h、1h，蛋進(jìn)入子宮后5 h、15h和成熟期屠宰雞，剝?nèi)〉皻?，采用磷酸緩沖液（pH＝7.4）清洗蛋殼，然后切片。采用螺旋測微器（0.001mm）測量蛋殼的厚度。

1.2.2 蛋殼的固定

將采集的蛋殼浸泡在2.5%戊二醛溶液（PBS溶液配制）過夜，磷酸緩沖液清洗干凈的蛋殼樣品；然后依次用40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精，分別浸泡30min左右，將蛋殼細(xì)胞組織內(nèi)的水置換出來，然后用叔丁醇置換乙醇，浸泡3次，每次30min，最后放置冰箱冷凍室（－20℃）中保存以備蛋殼超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.3 蛋殼元素測定及電鏡觀察

取每個(gè)時(shí)期的3個(gè)蛋殼各1塊（約1cm×1cm），外表面向上，拇指輕按，使其碎成小塊，用手術(shù)刀片沿每塊蛋殼以垂直于蛋殼外表面的角度取0.5cm×0.3 cm的小塊樣，按照外表面、內(nèi)表面、橫斷面粘于樣品臺(tái)上，噴金處理，使用掃描電鏡觀察蛋殼的超微結(jié)構(gòu)。Kevex Sigmatm X射線能譜儀測定蛋殼中元素的相對(duì)含量，取平均值為蛋殼元素的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋殼的厚度

采用螺旋測微器測得蛋進(jìn)入子宮前2h、蛋進(jìn)入子宮前1h、蛋進(jìn)入子宮后5h、蛋進(jìn)入子宮后15 h和成熟蛋殼的厚度（每個(gè)時(shí)間段取3個(gè)樣本），結(jié)果見表1。

由表1可見，隨著蛋進(jìn)入子宮的時(shí)間延長，蛋殼厚度也越來越大。

表1 不同時(shí)間段蛋殼的厚度Tab.1Thickness of eggshell in different times

2.2 蛋殼元素測定

在蛋進(jìn)入子宮前2h、蛋進(jìn)入子宮前1h、蛋進(jìn)入子宮后5h、蛋進(jìn)入子宮后15h、成熟期分別取3個(gè)蛋殼，對(duì)蛋殼橫斷面進(jìn)行能譜測定分析，結(jié)果見表2。

表2 不同時(shí)間段蛋殼元素組成Tab.2Elemental composition of eggshell in different times

表2顯示：

1）蛋殼中的鈣是組成蛋殼的主要元素成分，元素C、P、S是組成蛋殼中蛋白質(zhì)的重要來源。蛋殼中相對(duì)含量較高的元素為碳和鈣。

2）蛋進(jìn)入子宮前2h至蛋進(jìn)入子宮前1h，鈣含量變化的相對(duì)增量為10.84（A）；蛋進(jìn)入子宮前1h至蛋進(jìn)入子宮后5h，鈣含量變化的相對(duì)增量為11.45（B）；蛋進(jìn)入子宮后5h至蛋進(jìn)入子宮后15h，鈣含量變化的相對(duì)增量為9.47（C）；蛋進(jìn)入子宮后15h至蛋排出子宮，鈣含量變化的相對(duì)增量為2.17（D）。

根據(jù)以上4組數(shù)據(jù)得出鈣含量變化的相對(duì)增量柱狀圖，如圖1所示。

圖1 鈣沉積的相對(duì)增量柱狀圖Fig.1The relative difference between the amount of calcium deposition histogram

由圖1可見，蛋殼形成過程中鈣沉積的量越來越多，其中蛋進(jìn)入子宮前1h到蛋進(jìn)入子宮后5h時(shí)間段鈣沉積的增加量最多，之后鈣沉積的增加量逐漸減少，從形態(tài)上可以觀察到蛋殼由軟逐漸變硬。

2.3 蛋殼的超微結(jié)構(gòu)

2.3.1 橫斷面超微結(jié)構(gòu)

掃描電鏡顯微結(jié)果見圖2。

根據(jù)成熟蛋殼的顯微結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外可將蛋殼分為以下5層：a殼膜（即乳突層），b椎體層，c柱狀層，d表面晶體層，e覆蓋層170×。

由圖2可見，從蛋進(jìn)入子宮前2h、蛋進(jìn)入子宮前1h、蛋進(jìn)入子宮后5h、蛋進(jìn)入子宮后15h到成熟蛋殼，蛋殼的橫斷面逐漸變厚，而且椎體層越來越明顯，結(jié)合前面能譜分析得出，椎體層結(jié)構(gòu)可能對(duì)蛋殼結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起重要作用，隨著鈣沉積量增多，蛋殼的穩(wěn)定性變強(qiáng)，由此說明椎體層的厚度可能與蛋殼的鈣沉積量存在一定的聯(lián)系。

圖2 蛋殼橫斷面的超微結(jié)構(gòu)Fig.2Ultramicrosturtural structure of eggshell transect

2.3.2 外表面超微結(jié)構(gòu)

蛋進(jìn)入子宮不同時(shí)期蛋殼外表面的超微結(jié)構(gòu)見圖3。

由圖3可見，蛋進(jìn)入子宮前2h、蛋進(jìn)入子宮前1h、蛋進(jìn)入子宮后5h、蛋進(jìn)入子宮后15h到蛋排出子宮（成熟蛋殼）外表面的裂隙越來越少，而且深淺不一致，裂隙的嚴(yán)重程度和數(shù)量可能影響蛋殼的強(qiáng)度，而蛋殼的強(qiáng)度與鈣的沉積也有關(guān)系，所以裂隙的程度和數(shù)量可能與鈣沉積有密切關(guān)系。更確切的結(jié)果需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 蛋殼外表面的超微結(jié)構(gòu)Fig.3Ultramicrosturtural structure of eggshell outer surface

2.3.3 內(nèi)表面超微結(jié)構(gòu)

蛋進(jìn)入子宮不同時(shí)期蛋殼內(nèi)表面的超微結(jié)構(gòu)圖見圖4。

由圖4可見，蛋進(jìn)入子宮前2h、蛋進(jìn)入子宮前1 h、蛋進(jìn)入子宮后5h、蛋進(jìn)入子宮后15h到成熟蛋殼，其內(nèi)表面上的突起越來越少，纖維層的致密性和有序程度逐漸上升，空隙面積越來越小，表明蛋殼的致密度與蛋殼的強(qiáng)度密切相關(guān)。

圖4 蛋殼內(nèi)表面的超微結(jié)構(gòu)Fig.4Ultramicrosturtural structure of eggshell inner surface

3 討論

蛋雞排出卵子運(yùn)行到輸卵管峽部開始包被殼膜，在子宮中停留時(shí)間最長形成蛋殼［6］。這個(gè)過程大致為：首先在殼膜上形成乳突結(jié)節(jié)，然后以乳突結(jié)節(jié)為起點(diǎn)形成初級(jí)乳突單元，起初初級(jí)乳突單元較小，一端附著在殼膜上一端游離，隨著初級(jí)乳突單元逐漸長成成熟乳突單元，蛋白質(zhì)纖維和鈣混合沉積，即椎體層，蛋殼形成初期椎體層結(jié)構(gòu)比較疏松，椎體層達(dá)到一定厚度之后，柱狀層便有穩(wěn)定基礎(chǔ)，達(dá)到成熟蛋殼的致密結(jié)構(gòu)［7］。

本研究完整地展示了健康羅曼蛋雞蛋殼形成的不同時(shí)期、不同倍數(shù)的掃描電鏡顯微圖，殼膜位于蛋殼的最里面，與卵白蛋白直接相連，由蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成。構(gòu)成殼膜的蛋白質(zhì)纖維［8］與蛋殼的表面平行，層疊盤繞，縱橫交錯(cuò)，很難分出層次。蛋白質(zhì)纖維的表面分布許多顆粒狀突起和結(jié)節(jié)，這一研究結(jié)果與萬秋蓓等［9］、盧汰春等［10］對(duì)錦雞蛋殼和甘雅玲等［11］對(duì)馬雞蛋殼的研究結(jié)果相一致。結(jié)節(jié)將蛋白質(zhì)纖維連接起來，起到固定蛋白質(zhì)纖維，穩(wěn)定殼膜結(jié)構(gòu)的作用。椎體層是由椎體組成的，而椎體又由乳突和放射狀的鍥體構(gòu)成。隨著蛋的成熟，椎體結(jié)構(gòu)越來越明顯，鍥體呈現(xiàn)多角狀，并且直徑越來越大。這與Solomon等［12］提出的椎體和椎體層是相吻合的。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：自然成熟蛋殼的橫斷面較為堅(jiān)實(shí)、平滑，整體結(jié)構(gòu)致密；未成熟組蛋殼斷面凸凹不平，整體結(jié)構(gòu)致密性和平整性差，在不同產(chǎn)蛋時(shí)期蛋殼超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出隨著成熟度的不同，其致密程度存在差異，成熟度越高，蛋殼的致密性均有不同程度的增加。在蛋運(yùn)行的過程中即蛋進(jìn)入子宮前到進(jìn)入子宮后，蛋殼的外部形態(tài)由軟到硬，蛋殼中元素C、P、S的含量逐漸減少，鈣的含量逐漸增加，蛋殼的致密性、強(qiáng)度及厚度有明顯的增加。從蛋進(jìn)入子宮不同時(shí)期的橫切面可看出，蛋殼越來越厚，主要表現(xiàn)在柱狀層越來越明顯，柱狀層是由相互嵌合交聯(lián)的不規(guī)則柱狀晶體組成。柱狀晶體由次一級(jí)的棱柱體構(gòu)成。

一般認(rèn)為棱柱體是楔體的垂直延續(xù)。在掃描電鏡下，蛋殼的柱狀層由塊狀晶體單元組成，具有塊狀超微結(jié)構(gòu)［13］。這些晶體的存在增加蛋殼的整體性，對(duì)穩(wěn)定蛋殼有一定的影響。有研究［9，11］表明，柱狀層斷面上有很多可見的無機(jī)質(zhì)突起，突起上有許多大小不一的孔道，稱為氣孔。大的孔直徑約2μm，是胚胎和外界進(jìn)行氣體交換的通道，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。從橫切面還可以看出柱狀層之外是表面晶體層，隨著蛋的成熟，晶體排列越來越緊密，觀察蛋進(jìn)入子宮前1h、2h等早期的橫切面，推測晶體層可能是海綿狀結(jié)構(gòu)，它為蛋殼的韌性提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，至于這些晶體在蛋殼形成的過程中是如何排列的，需要進(jìn)行更精確的掃描定位。

自然成熟蛋殼的外表面皸裂較少，裂紋深度也較淺，內(nèi)表面纖維密集，主次分支清晰，層次分布均勻有序，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中多處可見微結(jié)節(jié)。未成熟蛋殼的外表面皸裂多，裂紋深度略大，局部皸裂已連通成網(wǎng)狀，內(nèi)表面纖維結(jié)構(gòu)松散，結(jié)構(gòu)層次性不佳，排布雜亂無序，主次分支混亂，纖維間有明顯裂隙，綜合觀察發(fā)現(xiàn)，蛋殼外表面皸裂數(shù)量和深度隨蛋殼逐漸成熟呈下降趨勢，蛋殼內(nèi)表面纖維結(jié)構(gòu)隨著蛋殼的成熟，分布致密度逐漸增加，纖維裂隙面積逐漸減少，裂隙的嚴(yán)重程度和數(shù)量可能影響蛋殼的強(qiáng)度［13，16］。

蛋殼形成后強(qiáng)度的大小可能與蛋殼殼膜的厚度有關(guān)，且蛋殼質(zhì)量主要受蛋殼中鈣含量的影響，同時(shí)蛋殼超微結(jié)構(gòu)致密程度［15，17］對(duì)蛋殼的質(zhì)量有一定影響。通過對(duì)蛋殼形成幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的掃描電鏡、能譜元素測定結(jié)合蛋殼外部形態(tài)的分析，認(rèn)為形成蛋殼厚度、強(qiáng)度的關(guān)鍵期在蛋進(jìn)入子宮中5h到15h時(shí)間段。

本研究對(duì)蛋殼在不同時(shí)期其結(jié)構(gòu)變化過程的測定和分析，為更深入的了解蛋殼形成過程，并在此基礎(chǔ)上探索蛋殼強(qiáng)度的調(diào)控機(jī)理及提高蛋殼質(zhì)量奠定了理論基礎(chǔ)。

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Element Composition and Ultramicrosturture of Eggshell in Different Laying Time of Chicken

SUN Jie，ZHAO Zongsheng，ZHAO Haixuan，LI Yan，YAO Xiujuan
（College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

During different laying time of eggshell elements and ultramicrosturtural structure were analyzed by scanning electronmicroscope and X－ray spectrometer.From the inner to the outer shell，the layer are：eggshell membrane，cone layer，column layer，the surface of the crystal layer and cover layer.The results indicated when entering the uterus，the egg has more time extending，the more thick eggshell increasing.The calcium content of eggshell became more and more.The eggshell strength may be related to the calcium content，the thickness of the shell membrane，the thickness fibers of the shell membrane，the size of gap between mammillary and the depth and number of crack in cover layer.

chicken；eggshell；element composition；ultramicrosturtural structure

S831.5；X513

A

1007－7383（2011）06－0706－06

2011－09－13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060305）

孫杰（1974－），女，副教授，從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究；e－mail：sunjie12＠tom.com。