HIF－1α和VEGF蛋白及其mRNA在豬膽腸吻合口組織中的表達及意義

楊宏強，彭心宇，張示杰，陳琳，張志偉，梁慧芳，李江，張宏偉，陳孝平

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，石河子832002；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院肝臟外科中心，武漢430030）

HIF－1α和VEGF蛋白及其mRNA在豬膽腸吻合口組織中的表達及意義

楊宏強1，2，彭心宇1，2，張示杰1，2，陳琳2，張志偉2，梁慧芳2，李江1，張宏偉1，陳孝平2

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，石河子832002；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院肝臟外科中心，武漢430030）

為了觀察豬膽腸吻合術(shù)模型的吻合口愈合過程中HIF－1α和VEGF的表達及其意義，建立豬的膽腸吻合手術(shù)模型，大體及組織HE觀察吻合口的愈合情況，用免疫組化和Real－time PCR法檢測膽腸吻合口組織中HIF－1α和VEGF蛋白及其mRNA分別在術(shù)后7、30、90和180d的表達。結(jié)果顯示：1例術(shù)后膽瘺死亡外，其余29例均存活。術(shù)后7、30、90和180d組膽腸吻合口均有不同程度的狹窄，180d狹窄最嚴(yán)重；HE染色觀察180d組狹窄的吻合口均有瘢痕組織增生。術(shù)后7d吻合口組織中HIF－1α和VEGF的蛋白及其mRNA的表達量最高（P＜0.05），30d及90d表達量降至很低水平，180dHIF－1α和VEGF的表達略有增高。結(jié)論：HIF－1α和VEGF參與了膽腸吻合口早期愈合過程及后期的瘢痕形成。

膽腸吻合術(shù)；缺氧誘導(dǎo)因子－1α；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；動物模型

膽腸吻合術(shù)是腹部外科常用的膽道重建方式，其術(shù)后主要并發(fā)癥是狹窄和膽瘺，術(shù)后膽腸吻合口的愈合情況直接影響治療效果和患者的生活質(zhì)量，膽腸吻合口愈合過程就是創(chuàng)傷愈合的過程，血管再生是創(chuàng)傷愈合過程中的一個重要環(huán)節(jié)，直接影響愈合的過程。細(xì)胞生長因子對這一過程的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此了解吻合口愈合過程中細(xì)胞生長因子的表達及作用，可以有針對性地干預(yù)治療，以促進吻合口的愈合，減少瘢痕，提高愈合質(zhì)量。

缺氧誘導(dǎo)因子－1α（hypoxia inducible factor－1α，HIF－1α）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是與血管再生密切相關(guān)的細(xì)胞因子，能夠刺激和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管的生成［1－3］。HIF－1α和 VEGF 在哺乳動物皮膚損傷愈合過程中起著重要的作用，但在膽腸吻合口的愈合過程中的研究較少。本研究通過建立豬的肝腸吻合手術(shù)模型，應(yīng)用病理學(xué)和分子生物學(xué)方法觀察膽腸吻合術(shù)后不同時間段膽腸吻合口組織中HIF－1α和VEGF蛋白及其mRNA的表達變化，初步探討其在膽腸吻合術(shù)后吻合口愈合過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選取同種系3月齡、質(zhì)量（20±1）kg的普通雌性家豬22只作為實驗動物。

1.1.2 主要試劑

HIF－1α鼠抗單克隆抗體和VEGF鼠抗單克隆抗體（美國Novus Biologicals公司），Envision免疫組化試劑盒、DAB免疫組化顯色試劑盒（丹麥DAKO Cytomation公司），Trizol（Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和SYBR Green反應(yīng)混合物購自TOYOBO公司（日本）；安氟醚吸入劑（250mL，上海雅培制藥有限公司），鹽酸氯胺酮注射液（0.1 mg，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），鹽酸阿托品注射液（1mg，山東華信制藥集團股份有限公司），鹽酸丙泊酚（靜安）注射液（20mL，北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司），地西泮（安定）注射液（10mg，甘肅蘭藥藥業(yè)集團有限責(zé)任公司），甲氰咪胍注射液（200 mg，海南皇隆制藥廠有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

將22只實驗用豬分為4組，分別為7d組、30d組、90d組和180d組，7d組和30d組各5只，90d組和180d組各6只，均行Roux－en－Y膽腸吻合術(shù)［4］。

1.2.2 膽腸吻合術(shù)動物模型的建立

1.2.2.1 術(shù)前處理

實驗用豬術(shù)前禁食12h，禁水6h。術(shù)前0.5h肌內(nèi)注射安定5mg，西咪替丁0.6g。術(shù)前術(shù)野脫毛。

1.2.2.2 麻醉方法

采用氣管插管全身麻醉，先用氯胺酮2mg／kg進行誘導(dǎo)麻醉，阿托品1mg肌注后行氣管插管，用安福醚吸入和異丙酚5（mg／kg）／h靜脈滴入復(fù)合麻醉。麻醉效果滿意后，行右側(cè)頸內(nèi)靜脈置管備靜脈輸液用。術(shù)中全程監(jiān)測生命體征的變化。

1.2.2.3 手術(shù)方法

取上腹正中切口，逐層開腹，游離膽總管及肝總管，切除膽囊、肝總管下段及膽總管中上段，結(jié)扎膽總管遠(yuǎn)端。用5－0可吸收線將肝總管斷端與小腸腸管行端側(cè)全口粘膜對粘膜、連續(xù)縫合，縫合邊距1.0～1.5mm、縫合間距1.0～1.5mm，以不漏膽汁為宜，并以Roux－en－Y方式進行腸道重建，無菌生理鹽水沖洗腹腔后關(guān)腹。術(shù)中不放置膽管支撐引流管及腹腔引流管。

1.2.2.4 術(shù)后處理

術(shù)后第1～2天禁食水，經(jīng)頸靜脈插管給予抗生素預(yù)防感染和補液治療。第3天給予限制半流飲食，第4天后不再限量飲食，術(shù)后1周內(nèi)每日用碘酒進行腹部切口消毒。

1.2.2.5 觀察指標(biāo)

各組分別飼養(yǎng)至術(shù)后7、30、90和180d處死，大體觀察吻合口愈合情況，取吻合口部位組織部分液氮凍存，另一部分用4%中性多聚甲醛溶液固定，制備石蠟標(biāo)本；用免疫組化和Real－time PCR法檢測膽腸吻合口組織內(nèi)HIF－1α和VEGF的蛋白及其mRNA在術(shù)后不同時期的表達。

1.2.3 實驗方法

1.2.3.1 HE染色

取吻合口組織石蠟標(biāo)本常規(guī)4m切片，采用常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察不同時期吻合口組織病理學(xué)變化。

1.2.3.2 免 疫 組 織 化 學(xué) 方 法 分 析 HIF－1α 和VEGF蛋白的表達

采用DAKO公司兩步法（ELPS法）：滴加一抗HIF－1α1∶500；VEGF 1∶200，4℃過夜。以Envision，Peroxidase，Goat孵育30min。DAB孵育1 min。蘇木素復(fù)染。結(jié)果評價：HIF－1α蛋白以細(xì)胞核或胞漿中有棕黃色顆粒為陽性，無反應(yīng)為陰性。VEGF蛋白以細(xì)胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒為陽性，無反應(yīng)為陰性。低倍鏡視野下觀察染色面積：＜25%記為1分，26%～50%記為2，51%～70%記為3分，＞71%記為4分；染色強度：無色記為1分，淺棕黃色記為2～3分，棕黃色記為4～5分，棕褐色記為6～7分，由2位病理科醫(yī)師分別獨立鏡檢。統(tǒng)計時記錄每張切片的染色面積、染色強度分值之和。以已知的陽性的組織切片做陽性對照。

1.2.3.3 實時熒光定量PCR檢測 HIF－1αmRNA和VEGF mRNA的表達

總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄：采用TOYOBO公司的RT－PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。取0.1g吻合口組織放入勻漿器中，加入1mL TRIZOL reageant在冰上勻漿30 min，抽取上清提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

熒光定量PCR檢測：HIF－1α、VEGF及內(nèi)參βactin的基因引物序列利用Primer5.0軟件設(shè)計。

HIF－1α 引 物 上 游：5′TTGAAGATGAAATGAAGGCACAGA 3′，

下 游：5′ATGGTCGCACGGATGAGTAAA 3′；

VEGF引物上游：5′GCCGTCCAATCGAGACCCT 3′，

下游：5′CATGGCGATGTTGAACTCCTC 3′。

內(nèi)參β－actin引物上游：退火溫度均為60℃。熒光定量PCR采用ABI公司的SYBRGreen PCR Master Mix試劑盒，25μL體系用ABI Prism7000 Sequence Detection System檢測。利用比較ct值法檢測HIF－1αmRNA、VEGFmRNA在組織中的表達情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，觀察結(jié)果指標(biāo)以描述，實驗組左右肝管數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，術(shù)后個時間點比較采用成組設(shè)計資料的t檢驗或t｀檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果分析

2.1 術(shù)后不同時期吻合口愈合情況

除90d組1例于術(shù)后第5天死于吻合口膽瘺外，其余實驗豬均成活。各組分別于術(shù)后7d、30d、90d和180d處死，大體病理觀察吻合口愈合情況。7d組吻合口水腫較明顯，吻合線尚未脫落，未出現(xiàn)明顯狹窄；30d、90d和180d組吻合口依術(shù)后時間遞增，出現(xiàn)不同程度的吻合口環(huán)形狹窄，180d組狹窄最明顯。

2.2 吻合口組織HE染色鏡下觀察

術(shù)后7d吻合口粘膜層基本對合，粘膜下層、肌層及漿膜層對接處有肉芽組織填充，連接緊密，內(nèi)可見大量的炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞浸潤，大量的新生毛細(xì)血管增生。術(shù)后30d膽管與腸管粘膜層完全對合，粘膜下層、肌層及漿膜層對接處有大量的膠原纖維組織填充，連接緊密，炎性細(xì)胞成分明顯減少，可見少量成熟的小血管及小膽管。術(shù)后90d膽管與腸管粘膜層對合良好，其內(nèi)見少量炎性細(xì)胞浸潤，吻合口粘膜下層見粗大的膠原纖維組織隆起，排列較雜亂。術(shù)后180d吻合口部分粘膜層脫落變薄，其內(nèi)見較多量炎性細(xì)胞浸潤，吻合口粘膜下層見纖維瘢痕組織隆起，膠原纖維粗大，排列雜亂，周圍可見少量小血管增生。

2.3 免疫組化檢測術(shù)后不同時期吻合口組織中HIF－1α和VEGF蛋白的表達

術(shù)后7d吻合口組織中陽性表達最多，HIF－1α和VEGF蛋白在粘膜上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及新生小血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)均有不同程度的陽性表達，與其他時期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 值均小于0.05）（圖1）。術(shù)后30、90d時，HIF－1α和VEGF在吻合口組織中無明顯陽性表達。術(shù)后180d時，HIF－1α和VEGF蛋白在吻合口瘢痕組織周圍小血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)有少量弱陽性表達。

圖1 免疫組化染色HIF－1α和VEGF蛋白在不同時期膽腸吻合口組織中的表達Fig.1Expression of the proteins of HIF－1αand VEGF in bilioenteric stoma of all the groups by Immunohistochemisty

2.4 Realtime PCR檢測術(shù)后不同時期吻合口組織中HIF－1αmRNA和VEGF mRNA的表達

結(jié)果見圖2。

圖2 Real time PCR檢測HIF－1α和VEGF mRNA在不同時期膽腸吻合口組織中的表達Fig.2Levels of HIF－1αand VEGF mRNA in bilioenteric stoma of all the groups were measured by realtime PCR

由圖2可見，術(shù)后不同時期HIF－1αmRNA和VEGF mRNA的表達量不同，但表達趨勢相同。術(shù)后7dHIF－1α和VEGF mRNA的表達量最高；術(shù)后30d及90d，其表達量均較低，術(shù)后180d其表達量略有升高，但與術(shù)后30d及90d比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后7d與其他時期比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均小于0.05）。

3 討論

血管再生是創(chuàng)傷愈合的一個重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞生長因子VEGF和HIF－1α對這一過程的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。參與創(chuàng)傷修復(fù)的很多類型的細(xì)胞都能產(chǎn)生VEGF，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等［5－6］。VEGF是一類作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖蛋白，是主要的血管生成因子之一，具有強烈的促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成的作用。目前發(fā)現(xiàn)，VEGF參與許多病理、生理過程，包括創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長等［7－10］。VEGF通過多種機制促進傷口愈合，包括：血管形成、膠原沉積、和上皮化等。VEGF具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖作用，增加血管的通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞Bcl－2基因表達，提高內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡能力。

HIF－1α是 HIF－1所特有的受低氧調(diào)控的亞基。正常氧飽和度下的組織細(xì)胞中，HIF－1α亞基在翻譯后易被蛋白酶降解。在組織缺氧時，HIF－1α亞基的降解被抑制，使得HIF－1α的含量明顯增加，得以和HIF－1β亞基結(jié)合形成有活性的復(fù)合物HIF－1，HIF－1是缺氧狀態(tài)下血管生成的核心調(diào)控因子，能夠控制多種促血管生成因子的合成，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、促紅細(xì)胞生成素、內(nèi)皮素－1等二十多種因子，直接參與血管生成的全過程［11］。

HIF－1對 VEGF的調(diào)控表現(xiàn)在多個層面上［12－13］，既 能 啟 動 VEGF 的 轉(zhuǎn) 錄，又 可 以 上 調(diào)VEGF受體Flt－1的轉(zhuǎn)錄，加強VEGF的生物學(xué)效應(yīng)［14］。Albina等［15］的研究結(jié)果表明，HIF－1α在創(chuàng)傷愈合的初期即開始表達，VEGF在其后在創(chuàng)傷組織中表達，HIF－1α促進了VEGF的表達，在創(chuàng)傷的修復(fù)過程中協(xié)同發(fā)揮作用。Elson等［1］研究表明，HIF－1αmRNA的表達與其調(diào)控的VEGF mRNA的表達保持一致性，均在創(chuàng)傷區(qū)域上皮化以前高表達，上皮化后表達明顯減少。本研究的結(jié)果顯示：膽腸吻合術(shù)后7d吻合口組織水腫，鏡下可見大量的肉芽組織、炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞存在，并可見大量的新生毛細(xì)血管，HIF－1αmRNA和VEGF mRNA及其蛋白在吻合口肉芽組織、及粘膜層中均有較高表達，提示在此時局部組織仍處于缺氧階段，HIF－1α誘導(dǎo)VEGF合成，加速新生血管的形成及肉芽組織成熟，促進傷口愈合。隨著新生血管的成熟和組織再灌注，局部組織缺氧狀態(tài)明顯改善，至術(shù)后30d，吻合口上皮化已完成，愈合良好，局部未見HIF－1α和VEGF蛋白水平的明顯表達。因此，VEGF mRNA與HIF－1αmRNA及其的表達在時間和空間上保持一致性，參與了膽腸吻合口的早期愈合，起著重要作用。

膽腸吻合術(shù)后180d，由于腸液、膽汁刺激所致吻合口局部長期慢性炎癥，吻合口處增生性瘢痕不斷增多，HIF－1α和VEGF又出現(xiàn)少量表達，有研究表明，VEGF能促進膠原的沉積，參與了增生性瘢痕的發(fā)生與發(fā)展［16］，所以，HIF－1α和 VEGF有可能在此時期加速增生性瘢痕的形成。

Liu等［2］的研究結(jié)果表明：愈合早期增強HIF－1α的表達及活性，能促進VEGF的合成，從而加速損傷部位的血管生成及上皮化，進一步促進和加速傷口愈合。Ishii等［17］的研究結(jié)果表明VEGF可以加速結(jié)腸吻合術(shù)后的愈合。因此，HIF－1α和VEGF可以作為促進膽腸吻合口早期愈合的靶點。VEGF對吻合口瘢痕形成和轉(zhuǎn)歸有一定調(diào)節(jié)作用，但其機制尚不明確，還有待經(jīng)一步研究。

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Role of HIF－1αmRNA and VEGF mRNA and Their Protein in the Local Tissues of Bilioenteric Stoma of Roux－en－Y
Cholangiojejunostomy Experimental Model in Pigs

YANG Hongqiang1，2，PENG Xinyu1，2，ZHANG Shijie1，2，CHEN Lin2，ZHANG Zhiwei2，LIANG Huifang2，LI Jiang1，ZHANG Hongwei1，CHEN Xiaopin2
（1Department of Hepatobiliary Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Medical College of Shihezi University，Shihezi 832008，China；2Hepatic Surgery Center，Tongji Hospital，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

To observe the role of HIF－1αand VEGF in the local tissues of bilioenteric stoma of Roux－en－Y cholangiojejunostomy experimental model in pigs，22cases Roux－en－Y cholangiojejunostomy experimentation animal model in pigs were established.According to the day of postoperation，the cases were divided into 4groups：7－day group （n＝5），30－day group（n＝5），90－day group（n＝6）and 180－day group（n＝6）.In the corresponding time，pigs of each group were put to death and the local tissues of bilioenteric stoma were observed by general pathology and HE staining.The amplification and expression of HIF－1αand VEGF gene were determined with and immunohistochemistry and realtime PCR in the different period postoperationly.The results showed that 21cases were alive，except one case in the 90－day group dead from biliary fistula at the 5th day post－operation.Different stage stenosis in bilioenteric stoma were present in all of the groups（7－day，30－day，90－day and 180－day group），the most serious stenosis was in the cases of the 180－day group.The scar tissues in bilioenteric stoma of all the groups were observed by HE staining.The most obvious scar tissue was present in the local tissues in bilioenteric stoma of the cases in 180－daygroup.The expression of HIF－1αand VEGF protein and their mRNA in the local tissues in bilioenteric stoma of the 7－day group were higher than that in the other groups significantly（P＜0.05）.The expression of HIF－1αand VEGF protein and their mRNA in the 30－day group and 90－day were down to very low level，and the expression in the 180－day group were increased slightly.The conclusion is that HIF－1αand VEGF play an important role in the early healing process of Roux－en－Y cholangiojejunostomy and cicatrization in the later healing process of bilioenteric stoma.

Roux－en－Y cholangiojejunostomy；hypoxia－inducible factor－1；vascular endothelial growth factor；animal experimentation

R656

A

1007－7383（2011）06－0722－05

2011－09－26

新疆兵團衛(wèi)生科技攻關(guān)重點項目（2010GG54），石河子大學(xué)重大科技攻關(guān)項目（gxji2008－zdgg06）

楊宏強（1972－），副主任醫(yī)師，副教授，博士生，從事肝膽外科學(xué)研究；e－mail：hongq01＠hotmail.com。

陳孝平（1953－），教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事肝臟外科學(xué)研究。