酶解葵花籽粕蛋白制備降血壓肽的工藝研究

王 婷，何榮海，*，楊進妹，馬海樂

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇鎮(zhèn)江212013）

酶解葵花籽粕蛋白制備降血壓肽的工藝研究

王 婷1，2，何榮海1，2，*，楊進妹1，馬海樂1，2

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇鎮(zhèn)江212013）

建立胰蛋白酶水解葵花籽粕蛋白制備降血壓肽的工藝。以酶解物對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率、苦味值和蛋白水解度為指標，對pH、溫度、底物濃度、加酶量和酶解時間等酶解條件進行單因素實驗，并在此基礎(chǔ)上，選擇酶解時間、pH、溫度等參數(shù)通過正交實驗，確定了酶解葵花籽粕蛋白制備降血壓肽的最優(yōu)參數(shù)組合為：底物濃度為3.5%，加酶量2.85%，pH7.5、溫度45℃和酶解時間5min，所得葵花籽粕降血壓肽產(chǎn)品的IC50值為6.06mg/mL。

葵花籽粕蛋白，降血壓肽，酶水解

葵花籽是一種重要的植物油來源，葵花籽中無有毒成分，蛋白質(zhì)含量為21%～39%，抽提過油后的粕是一種有價值的蛋白資源［1-3］。60年代以來，全世界向日葵的產(chǎn)量在油料作物中僅次于黃豆，位于第二位。我國北方地區(qū)近年的產(chǎn)量也越來越高，葵籽餅粕產(chǎn)量在所有油料餅類中居第二位，開發(fā)利用潛力很大。當前由于蛋白質(zhì)飼料價格高且資源不足，人們逐步認識到開發(fā)和利用棉籽粕、菜籽粕和葵花粕等的重要性［4］。近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了大量具有生理功能的食品，其中源于食品蛋白質(zhì)中的生物活性肽倍受注目。這些肽在原蛋白質(zhì)序列中并沒有活性，當用體外酶或體內(nèi)腸道酶使它們從原有序列中釋放出來，就表現(xiàn)出某種活性［5］。其中較引人關(guān)注的是降血壓肽，它在動物體內(nèi)有降血壓作用，在體外實驗中對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）有抑制作用，又被稱為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。國內(nèi)外從玉米、大豆、牛乳、麥胚、紫菜等許多蛋白中制備降血壓肽已經(jīng)獲得成功［6-10］?？ㄗ哑傻鞍踪|(zhì)含量高，含有多種重要氨基酸，因此，以葵花籽粕蛋白為原料生產(chǎn)食品蛋白質(zhì)降血壓肽為菜籽餅粕高附加值利用提供了新途徑，目前這方面的報道很少見。本文建立以水解度、ACE抑制率和苦味值為評價指標，酶法生產(chǎn)葵花籽粕蛋白降血壓肽的工藝，其中包括酶解過程單因素實驗、酶解條件的優(yōu)化實驗，選擇最優(yōu)參數(shù)組合，進一步進行驗證，為工業(yè)化生產(chǎn)提供可行的工藝。

表2 葵花籽粕主要成分

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

葵花籽粕 由新疆金新海油脂有限公司提供；胰蛋白酶 中國醫(yī)藥集團；N-［（2S，3R）-3-氨基-2 -羥基-4-苯丁酰］-L-亮氨酸（FAPGG） Sigma-Aldrich中國有限公司；苦丁茶 市售，安徽黃山歙縣金嶺茶菊精制廠；鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鈣、甲醛均為分析純。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；pHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；JZ5002電子天平 上海天平儀器廠；1500型全波長酶標分析儀美國Thermo Electron公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料成分分析與葵花籽粕蛋白提取 采用堿溶酸沉法提取葵花籽粕蛋白。稱取一定量去除綠原酸后的原料，按料液比1∶10加入水，水浴加熱，溫度為50℃，攪拌，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至9.0，提取1h，將溶液在4℃條件下，10000r/min，離心20min，留取上清液。

1.2.2 酶解單因素實驗 根據(jù)本研究前期實驗的結(jié)果選擇胰蛋白酶對葵花籽粕蛋白溶液進行酶解，考察影響酶解的各因素，單因素實驗中除考察因素外，其他因素的條件為：底物濃度3.5g/100mL、加酶量2.85%（E/S），酶解溫度50℃，酶解時間10min。酶解后，沸水浴滅酶10min，以酶解液的水解度、對ACE的抑制率為實驗檢測指標，同時比較各種酶解液的苦味值，篩選出各因素效果最佳的水平。

1.2.3 酶解制備葵花籽粕蛋白降血壓肽的正交實驗 通過對單因素實驗的結(jié)果進行離差平方和計算，選擇影響ACE抑制率最大的幾個因素進行正交實驗，正交實驗水平設(shè)計如表1。選擇最優(yōu)制備參數(shù)組合，進一步進行驗證，為工業(yè)化生產(chǎn)提供可行性的工藝。

表1 正交實驗水平設(shè)計

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)水解度的測定［11］取滅酶后的8.0mL水解液，置于150mL的燒瓶中，加60mL去CO2水，調(diào)節(jié)pH為7.0。向燒瓶中加入10mL中性甲醛溶液，混勻。開動磁力攪拌器，用濃度為 0.05mol/L的NaOH標準溶液滴定至pH為9.2，記錄下此時滴定管中的NaOH溶液的體積消耗數(shù)V1。同時，取相同濃度未水解蛋白溶液8.0mL，按上述方法作空白實驗，記錄此時滴定管中NaOH標準溶液的體積消耗數(shù)V2，則蛋白的水解度的計算公式為：

式中：M為NaOH標準溶液的濃度，mol/L；V1為滴定樣品稀釋液消耗的0.05mol/L的NaOH標準溶液的體積，mL；V2為空白實驗所消耗的0.05mol/L的NaOH標準溶液的體積，mL；CWD為所用WPC溶液的蛋白質(zhì)量濃度，g/L；V為用于甲醛滴定的水解液的體積，mL；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，對葵花籽粕蛋白，該值取7.5。

1.3.2 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的測定 用移液槍向96孔酶標板每測試孔中加入10μL提取的ACE，加入40μL稀釋后的酶解液，加入50μL FAPGG（1.0mmol/L），用40μL緩沖液代替酶解液作為空白實驗，將加好試劑的96孔酶標板置于酶標儀中于340nm處測其吸光值，接著于37.5℃保溫培養(yǎng)30min，再次測其吸光值。每組樣品做三次平行實驗。計算公式：

式中：Abs1為空白對照培養(yǎng)30min后的吸光值，Abs0為空白對照培養(yǎng)30min前的吸光值，Abs3為樣品培養(yǎng)30min后的吸光值，Abs2為樣品培養(yǎng)30min前的吸光值。

1.3.3 酶解液苦味值的測定 參照楊蘭［12］等的方法，以1g苦丁茶溶于1L水中，煮沸1h，過濾澄清后定容至1000mL，并將其分別稀釋至150、100、75、50、25、0mg/kg，其苦味值分別定義為12、10、8、6、4、2、0。

將酶解物滅酶后取適量，由味覺靈敏的三人評定小組與苦丁茶對照組比較得出苦味值。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料成分分析與葵花籽粕蛋白提取結(jié)果

葵花籽粕成分的測定結(jié)果見表2所示。

由表2可以看出，所購葵花籽粕原料中營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量為26.13%，是一種高蛋白、低脂肪的食品加工副產(chǎn)物，是開發(fā)保健食品的良好材料。

采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法按照1.2.1工藝提取出葵花籽粕中的蛋白的得率為85.3%，純度為79.2%。

2.2 酶解單因素實驗結(jié)果與分析

分別以酶解液水解度、ACE抑制率和苦味值為指標進行單因素實驗，結(jié)果如下：

2.2.1 時間對酶解液水解度、ACE抑制率和苦味值的影響 實驗結(jié)果列于圖1。

由圖1可以看出，隨著時間的增加，酶解液的ACE抑制率先增加后減小，在前4min增加幅度很大，時間為4min時ACE抑制率最大，在4min后抑制率反而下降，在4～30min抑制率下降幅度很大，30min之后抑制率緩慢下降，幅度較小。隨著時間的增加，酶解液的水解度在前30min增加幅度較大，30min后繼續(xù)增加但幅度減小。

圖1 不同時間底物濃度下酶解液的水解度、ACE抑制率和苦味值的變化

在酶解前4min時間內(nèi)，酶解液ACE抑制率相對較高的原因可能是胰蛋白酶是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷形成大量多肽，產(chǎn)生ACE抑制活力，繼續(xù)反應(yīng)，由于多肽進一步發(fā)生酶水解反應(yīng)，使得ACE抑制活性降低。具體原因有待進一步研究。由圖1可以看出，隨著時間的增加，酶解液的苦味值是逐步增加的。

2.2.2 pH對酶解液水解度、抑制率和苦味值的影響實驗結(jié)果列于圖2。

圖2 不同pH下酶解液的水解度、ACE抑制率和苦味值的變化

由圖2可以看出，隨著pH的增加，酶解液的ACE抑制率先增加后減小，pH為8時ACE抑制率最大。隨pH的升高，水解度先升高后降低，pH為8時水解度最高。酶解液的苦味值隨著pH的增加先增加后減小，pH為8和8.5時苦味值最大。

2.2.3 溫度對酶解液水解度、ACE抑制率和苦味值的影響 實驗結(jié)果列于圖3。

圖3 不同溫度下酶解液的水解度、ACE抑制率和苦味值的變化

由圖3可以看出，隨著溫度的增加，酶解液的ACE抑制率先增加后減小，溫度為45℃時ACE抑制率最大。隨溫度的升高，水解度先升高后降低，溫度為50℃時水解度最高。酶解液的苦味值隨著溫度的增加先增加后減小，溫度為45℃時苦味值最大。

2.2.4 加酶量對酶解液水解度、ACE抑制率和苦味值的影響 實驗結(jié)果列于圖4。

由圖4可以看出，隨著加酶量的增加，酶解液的ACE抑制率增加，2.85%后增幅不大。隨著加酶量的增加，酶解液的水解度增加，2.85%后增幅不大，酶解液的苦味值先增加后減小，加酶量為2%時苦味值最大。

圖4 不同加酶量下酶解液的水解度、ACE抑制率和苦味值的變化

2.2.5 底物濃度對酶解液ACE抑制率、水解度和苦味值的影響 實驗結(jié)果列于圖5。

圖5 不同底物濃度下酶解液的水解度、ACE抑制率和苦味值的變化

由圖5可以看出，隨著底物濃度的增加，酶解液的ACE抑制率先增加后減小，底物濃度為3.5%時，ACE抑制率最大。隨著底物濃度的增加，酶解液的水解度略有降低，但下降幅度很小，酶解液的苦味值先減小后增加，底物濃度為4%時苦味值最小。

2.3 葵花籽粕蛋白降血壓肽制備工藝的正交實驗結(jié)果與分析

對單因素實驗結(jié)果進行平均離差平方和計算，得到pH、溫度、加酶量、底物濃度和時間的Q/E值分別為233.46、276.77、113.91、62.80、325.53。由各因素的平均離差平方和可知，對提取率影響程度從大到小的因素依次為時間、溫度、pH、加酶量、底物濃度。根據(jù)該結(jié)果，把時間、溫度、pH三個因素選入正交表?？紤]到加酶量和底物濃度的影響程度不大以及成本優(yōu)化，決定在正交實驗時采用加酶量為2.85%，底物濃度為3.5%。

實驗結(jié)果與極差分析如表3所示。由表3可以看出，影響蛋白提取率的三個因素中，按極差大小其主次順序為B＞A＞C，即液料溫度對蛋白提取率的影響最大，pH的影響次之，酶解時間的影響最小。分析可知，提取條件的最優(yōu)組合為A1B2C3，即pH7.5、溫度45℃、酶解時間5min。

以空白列為誤差列，用F檢驗對各因素進行方差分析（α=0.05），得到結(jié)果為液料溫度對酶解液ACE抑制率有顯著影響。影響因素的主次順序是B＞A＞C，即方差分析的結(jié)果與極差分析的結(jié)果一致。

由于提取條件的最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在正交表中，所以對最優(yōu)組合的工藝條件進行驗證實驗，結(jié)果酶解物的ACE抑制率為77.1%、IC50值為6.06mg/mL。

表3 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

3 結(jié)論

以產(chǎn)物高活性、低苦味為目標，采用胰蛋白酶水解葵花籽粕蛋白，選擇時間、溫度、pH、加酶量和底物濃度這五個因素進行單因素實驗，其中溫度、時間和pH對酶解過程影響較加酶量和底物濃度大。經(jīng)正交實驗，最優(yōu)參數(shù)組合為：底物濃度3.5%，加酶量2.85%，pH7.5、溫度45℃和酶解時間5min，所得葵花籽粕降血壓肽產(chǎn)品的IC50值為6.06mg/mL。胰蛋白酶酶解葵花籽粕蛋白在前10min內(nèi)ACE抑制率比較高，其作用過程和機理需要作進一步研究。

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Study on the preparation of antihypertensive peptides from sunflower seed meal protein by enzymolysis

WANG Ting1，2，HE Rong-hai1，2，*，YANG Jin-mei1，MA Hai-le1，2
（1.School of Food and Biological Engeering at JiangSu University，Zhenjiang 212013，China；2.Jiangsu Province Research Center of Bio-process and Separation of Agri-products，Zhenjiang 212013，China）

The preparation condition of antihypertensive peptides from sunflower seed meal protein by trypsin enzymolysis was established.Single factor experiments were carried out to investigate the effects of pH value，enzymolysis temperature（T），substrate content（SC），trypsin content（TC），and enzymolysis time（t）on the inhibitory rate of Angiotensin-converting Enzyme（ACE），the degree of hydrolysis，and the bitterness of hydrolysate of sunflower seed meal protein.Based on results of the single factor experiments，orthogonal experiment on enzymolysis conditions of pH value，T and t were explored and the optimal enzymolysis parameters were determined as：SC 3.5%（m/v），TC 2.85%（E/S），pH7.5，T 45℃，and t 5min.And the 50%ACE inhibitory rate conten（tlC50value）of the hydrolysate under the optimal condition was 6.06mg/mL.

sunflower seed meal protein；antihypertensive peptides；enzymatic hydrolysis

TS201.1

B

1002-0306（2010）11-0268-04

2009-10-09 *通訊聯(lián)系人

王婷（1986-），女，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物有效成分的提取與分離研究。

中國博士后基金（20100471386）；江蘇省博士后基金（0902029C）；江蘇大學(xué)高級人才科研啟動基金項目（08JDG032）。