具有抑制單胺氧化酶活性的干酪乳桿菌JH-23生長(zhǎng)特性及生理功能研究

王 豪，郭本恒，王蔭榆，吳正鈞

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436）

具有抑制單胺氧化酶活性的干酪乳桿菌JH-23生長(zhǎng)特性及生理功能研究

王 豪1，郭本恒2，*，王蔭榆2，吳正鈞2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436）

以具有體外抑制單胺氧化酶作用的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）JH-23作為研究對(duì)象，考察了其部分生長(zhǎng)特性和生理功能。L.casei JH-23屬于厭氧型的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，無(wú)芽孢。該株菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH為6.0，最適接種量為3%，MRS中24h培養(yǎng)結(jié)束后活菌數(shù)可達(dá)1.11×109cfu/mL，在脫脂乳中具有良好的保藏性能。生理功能實(shí)驗(yàn)顯示，L.casei JH-23在pH為3.0的環(huán)境下生長(zhǎng)3h后存活率可達(dá)到65.32%，對(duì)酸性環(huán)境有較強(qiáng)的耐受性；最高膽鹽耐受濃度為0.5%，最高NaCl耐受濃度為6%，這些結(jié)果表明，L.casei JH-23作為益生菌有著很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

干酪乳桿菌JH-23，生長(zhǎng)特性，生理功能

益生菌是一類通過(guò)改變宿主某一部位菌群的組成，從而產(chǎn)生有利于宿主健康作用的單一或組成明確的混合微生物。益生作用則是指某種微生物制劑或發(fā)酵制品通過(guò)調(diào)節(jié)宿主黏膜與系統(tǒng)免疫功能以及改善腸道營(yíng)養(yǎng)與菌群平衡對(duì)宿主所產(chǎn)生的有益的生理作用［1］，益生作用的范圍可分為營(yíng)養(yǎng)、生理作用和抗菌作用。鑒于益生菌眾多的功能性作用，目前已將其應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)，主要的益生菌有雙歧桿菌和乳桿菌等。近年來(lái)關(guān)于益生菌降血脂、抗高血壓、降膽固醇等功能性作用已得到證實(shí)，但對(duì)于益生菌的抗衰老作用研究的很少。前期實(shí)驗(yàn)中篩選出一株具有抑制單胺氧化酶活性的干酪乳桿菌JH-23，單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO，EC 1.4.3.4）在機(jī)體內(nèi)的主要功能是催化內(nèi)源性和外源性單胺類物質(zhì)的代謝。人體中MAO的含量從45歲起隨年齡的增加而急劇增加，被認(rèn)為是老化的標(biāo)志，又稱之為老化相關(guān)酶，該酶活性的不斷升高會(huì)引起整個(gè)機(jī)體逐步衰老［2］。據(jù)報(bào)道，帕金森病、老年癡呆病以及近年來(lái)都市中較為流行的抑郁癥等病理性衰老疾病均與MAO活性異常有關(guān)［3-4］，說(shuō)明MAO與衰老有密切關(guān)系。MAO直接涉及到了人體的衰老過(guò)程，其含量與年齡的增加成正相關(guān)，是衰老的特征指標(biāo)，因此篩選出的MAO抑制劑意味著有潛在的抗衰老作用。有鑒于此，具有抑制MAO活性的干酪乳桿菌JH-23將來(lái)可能會(huì)應(yīng)用到食品特別是乳品中，開發(fā)輔助抗衰老作用的功能性乳制品，以滿足人們健康的需要。所以有必要對(duì)該干酪乳桿菌的一些生長(zhǎng)特性和生理功能進(jìn)行研究，從而更好地了解該益生菌的特性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌種 前期實(shí)驗(yàn)篩選并鑒定得到的干酪乳桿菌JH-23；?；悄懰徕c Sigma公司；溴甲酚紫 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基 Merck公司；其它為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析純化學(xué)試劑。

Avanti J30I高速冷凍離心機(jī) Beckman Coulter公司；TH-CB-402型超凈工作臺(tái) LABCONCO公司；厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)RUSKINN TECHNOLOGY LIMITED公司；PHS-25型pH計(jì) 奧立龍公司；恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SPECORD 205型紫外分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株生長(zhǎng)特性研究

1.2.1.1 菌落和菌體形態(tài)以及液體培養(yǎng)特征觀察L.casei JH-23在MRS平板劃線分離，37℃厭氧培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)；同時(shí)按1%接種量接到MRS液體中，37℃培養(yǎng)24h，觀察液體生長(zhǎng)情況。接種環(huán)挑取6h培養(yǎng)液到載玻片涂片，革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)并攝影記錄。

1.2.1.2 菌株最適生長(zhǎng)溫度和最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定［5］L.casei JH-23按1%接種量接入MRS-broth，放置于不同溫度（25、30、34、37、40、45℃）培養(yǎng)16h，以沒有接種的培養(yǎng)基作參比，于620nm測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值，依據(jù)光密度的大小確定最適生長(zhǎng)溫度。

同時(shí)接種JH-23到不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的MRS液體培養(yǎng)基中，在最適溫度下培養(yǎng)16h，以沒有接種的同pH液體培養(yǎng)基作參比，于620nm測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值，依據(jù)光密度的大小確定最適生長(zhǎng)pH。

1.2.1.3 菌株生長(zhǎng)最適接種量的測(cè)定 以接種量（1%、3%、5%、7%、9%）將種子液接入MRS-broth中，37℃靜置培養(yǎng)16h后，采用傾注平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以活菌數(shù)作為最適接種量的指標(biāo)。

1.2.1.4 菌株產(chǎn)酸能力檢驗(yàn)和生長(zhǎng)曲線的繪制［6］活化好的菌株JH-23按1%接種量接于200mL MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，每隔2h測(cè)定培養(yǎng)液中的活菌數(shù)和pH。發(fā)酵液pH用pH計(jì)測(cè)定，活菌數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法，以活菌數(shù)對(duì)數(shù)值和pH對(duì)時(shí)間作圖，得到菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.1.5 菌株保藏特性研究方法 L.casei JH-23按1%量接入MRS液體，收集到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末的菌液，一部分以MRS發(fā)酵原液形式放入冰箱4℃保存；另一部分3000×g，4℃離心15min收集菌體，無(wú)菌水洗滌兩次，菌體懸浮在10%的SKM中，放入冰箱4℃保存。采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，在第0、7、14、21d分別對(duì)兩種保藏液體中的活菌計(jì)數(shù)。

1.2.2 菌株生理功能研究

1.2.2.1 菌株耐酸能力測(cè)定［7］L.casei JH-23按1%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液3000×g，4℃離心15min收集菌體，收集的菌體用滅菌的生理鹽水洗滌3遍。之后菌體分別懸浮于pH為2.0、3.0、4.0和5.0的MRS液體培養(yǎng)基中，以pH為5.7±0.2的MRS液體培養(yǎng)基為常規(guī)對(duì)照，37℃培養(yǎng)3h，測(cè)定存活率。

1.2.2.2 菌株膽鹽耐受能力的測(cè)定［8］將活化的菌株按1%的接種量接種于含不同濃度牛磺膽酸鈉（TCA）的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，于0h和16h分別測(cè)定OD620，計(jì)算兩者差值；同時(shí)在不同TCA濃度的MRS瓊脂平板上劃線，37℃厭氧培養(yǎng)48h后觀察生長(zhǎng)情況。

1.2.2.3 菌株對(duì)NaCl耐受性的測(cè)定［9］在MRS液體管中加入NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、2%、4%、6%、8%、9%、10%、11%），滅菌后接種，37℃厭氧培養(yǎng)，以溴甲酚紫為指示劑，觀察培養(yǎng)基顏色變化和菌體生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生長(zhǎng)特性研究

2.1.1 L.casei JH-23菌落和菌體形態(tài)以及液體培養(yǎng)特征觀察 L.casei JH-23在MRS平板上劃線分離，其菌落形態(tài)如圖1-A所示：菌落直徑為0.3～2mm，圓形，邊緣整齊，正面凸起，乳白色，不透明，表面濕潤(rùn)光滑。JH-23為G+，桿狀細(xì)菌，不產(chǎn)芽孢，菌體大小為0.4～1.0μm寬，2～8μm長(zhǎng)，具體的菌體形態(tài)如圖1-B。

L.casei JH-23在液體MRS中培養(yǎng)，4h左右培養(yǎng)液開始渾濁并伴有菌體細(xì)胞沉淀物產(chǎn)生，12h左右生長(zhǎng)物均勻渾濁，輕輕搖動(dòng)沒有氣泡產(chǎn)生，16h有大量菌體沉淀，沉淀結(jié)構(gòu)疏松，24h乳白色沉淀明顯。

圖1 JH-23的菌落和菌體形態(tài)

2.1.2 L.casei JH-23的最適生長(zhǎng)溫度 確定菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)情況對(duì)于其保存和處理具有指導(dǎo)意義，L.casei JH-23的最適生長(zhǎng)溫度如圖2所示。

從圖2中可以看出，L.casei JH-23在25℃及45℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢，30～40℃間生長(zhǎng)較好，該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為 37℃，與一般乳酸菌的最適溫度相似［10］。

2.1.3 L.casei JH-23的最適生長(zhǎng) pH 將 L.casei JH-23接種到不同起始pH的MRS液體試管中，37℃靜置培養(yǎng)，測(cè)定菌株在不同pH條件下培養(yǎng)16h的OD620，結(jié)果如圖3。

圖2 L.casei JH-23的最適生長(zhǎng)溫度

圖3 L.casei JH-23的最適生長(zhǎng)pH

從圖3可以看出，L.casei JH-23在pH4.0至10.0的范圍均可生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)pH為6.0。

2.1.4 L.casei JH-23的生長(zhǎng)最適接種量 圖4顯示，按3%（v/v）接種量將L.casei JH-23接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)16h，活菌數(shù)可達(dá)到1.18× 109cfu/mL。相對(duì)于其它接種量而言，3%接種量所得到的發(fā)酵液中活菌數(shù)最多，即最適接種量為3%。

圖4 L.casei JH-23的最適接種量

2.1.5 L.casei JH-23生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 菌株的生長(zhǎng)過(guò)程可以通過(guò)細(xì)胞數(shù)的測(cè)定和培養(yǎng)基pH變化來(lái)反映，其比較直觀地體現(xiàn)出乳酸菌在一定條件下的群體生長(zhǎng)規(guī)律。

按上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將活化好的L.casei JH-23按3%（V/V）的接種量接入MRS-broth培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔2h取樣測(cè)定其發(fā)酵液中的活菌數(shù)量和pH，得到如圖5的生長(zhǎng)曲線。

圖5顯示，在MRS培養(yǎng)基中，JH-23在2h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。進(jìn)入穩(wěn)定期前，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，pH不斷降低。進(jìn)入穩(wěn)定期后，pH下降趨勢(shì)漸緩。說(shuō)明穩(wěn)定期JH-23仍在生長(zhǎng)，只是生長(zhǎng)和死亡形成動(dòng)態(tài)平衡［11］，24h培養(yǎng)結(jié)束，pH為3.70，培養(yǎng)液中 JH-23活菌濃度為 1.01× 109cfu/mL。

2.1.6 L.casei JH-23在4℃的保藏特性 在4℃保藏過(guò)程中，于第0、7、14、21d分別測(cè)定菌株在MRS和 SKM中的活菌數(shù)，以log10活菌數(shù)對(duì)天數(shù)（d）作圖，如圖6得到L.casei JH-23在4℃的保藏特性曲線。

圖5 L.casei JH-23在MRS中的生長(zhǎng)曲線

圖6 L.casei JH-23在MRS發(fā)酵液（A）和脫脂乳（B）中的保藏曲線

從圖6可以看出，L.casei JH-23的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值隨保藏時(shí)間的增加呈線性下降，L.casei JH-23在pH 3.7的MRS和pH 6.2的SKM中4℃保藏，活菌數(shù)減少一個(gè)數(shù)量級(jí)所需時(shí)間分別為18.13d和42.76d。可見，懸浮L.casei JH-23在中性SKM中，具有良好的保藏性能。

2.2 菌株生理功能研究

2.2.1 L.casei JH-23耐酸性實(shí)驗(yàn) 微生態(tài)制劑經(jīng)口服后首先到達(dá)胃，這就要求乳酸菌要具有較強(qiáng)的耐酸能力，才能夠保證一定數(shù)量的活菌順利通過(guò)胃酸環(huán)境而到達(dá)腸內(nèi)。胃液pH的大小根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)不同而波動(dòng)很大，通常pH為3左右，空腹或食用酸性食品時(shí)，pH可達(dá)1.5；食用堿性食物時(shí)，pH為4～5，且食物（尤其是流體）通過(guò)胃的時(shí)間相對(duì)較短，一般為1～2h［12］。

圖7 L.casei JH-23的耐酸能力

由圖7可見，L.casei JH-23的存活率隨著培養(yǎng)基pH的降低而下降，在pH為3.0的環(huán)境下生長(zhǎng)3h后存活率可達(dá)到65.35%，pH2.0時(shí)雖然有大量活菌死亡，但仍有部分細(xì)菌存活下來(lái)，存活率為15.46%，說(shuō)明該菌株對(duì)酸性環(huán)境有較強(qiáng)的耐受力。

2.2.2 L.casei JH-23耐膽汁鹽實(shí)驗(yàn) 微生物對(duì)膽鹽的抗性是其能夠在腸道存活、生長(zhǎng)并發(fā)揮功效的先決條件之一。?；悄懰徕c（TCA）是膽鹽中的主要成分，在此次實(shí)驗(yàn)中作為菌株膽鹽耐受力的指標(biāo)，L.casei JH-23在不同TCA濃度的MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如表1所示。

表1 L.casei JH-23對(duì)不同濃度膽鹽的耐受性（n=3）

人體小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%之間，能夠在正常生理膽鹽濃度中生長(zhǎng)和代謝的菌株才可能在腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中存活［13］。如表1所示，L.casei JH-23所能耐受MRS中膽鹽的最大濃度為0.5%，較小腸內(nèi)最高膽鹽含量（0.3%）要高，作為益生菌具有較強(qiáng)的膽鹽耐受力。

2.2.3 L.casei JH-23的NaCl耐受性 菌株的NaCl耐受性也是菌株的重要特性之一，其耐受值的高低體現(xiàn)了菌株所能耐受的滲透壓以及在腸道中存活能力的高低，L.casei JH-23的NaCl耐受性如表2所示。

表2 L.casei JH-23菌株在不同NaCl濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況

由表2可見，L.casei JH-23在質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于4%的NaCl濃度下生長(zhǎng)良好，在6%的濃度下生長(zhǎng)一般，而在8%的NaCl濃度下略有生長(zhǎng)，NaCl濃度9%以上不生長(zhǎng)，所以L.casei JH-23能夠耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的NaCl。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)具有體外抑制MAO活性的L.casei JH-23的部分生長(zhǎng)特性和生理功能進(jìn)行了研究。菌株JH-23屬于厭氧型的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，無(wú)芽孢。最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH為6.0，最適接種量為3%。MRS培養(yǎng)基比脫脂乳培養(yǎng)基更適合其生長(zhǎng)，MRS中 24h培養(yǎng)結(jié)束后活菌數(shù)可達(dá) 1.11× 109cfu/mL，但該菌株在脫脂乳中具有更優(yōu)的保藏性能。

L.casei JH-23在pH為3.0的環(huán)境下生長(zhǎng)3h后存活率可達(dá)到65.32%，對(duì)酸性環(huán)境有較強(qiáng)的耐受性，其最高膽鹽耐受濃度為0.5%，最高NaCl耐受濃度為6%，這些結(jié)果表明L.casei JH-23作為益生菌有較好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

［1］郭本恒.益生菌［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：61-62.

［2］賈雪梅，齊易祥.單胺氧化酶與衰老［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)老年醫(yī)學(xué)分冊(cè)，1988（4）：145-147.

［3］Bodkins JA，Amsterdam JD.Transdermal selegiline in major depression：a double-blind，placebo-controlled，parallel-group study in outpatients［J］.American Journal of Psychiatry，2002，159：1869-1875.

［4］Blandini F，Armentero MT，F(xiàn)ancellu R，et al.Neuroprotective effect of rasagiline in a rodent model of Parkinson’s disease［J］. Experimental Neurology，2004，187：455-459.

［5］趙建新，田豐偉，陳衛(wèi)，等.Clostridium butyricum Z-10的生長(zhǎng)特性與培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（1）：75-79.

［6］Johnson TR，Case CL.Laboratory experiments in microbiology［M］.Redwood City，California：Benjamin/Cummings Publishing Company，1995，4th edition.

［7］禹慧明，林勇.益生乳桿菌的篩選及特性研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（1）：53-56.

［8］張和平，孟和畢力格，王俊國(guó)，等.分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中L.casei Zhang潛在益生特性的研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2006，34（4）：4-10.

［9］呂兵，張國(guó)農(nóng)，楊瑞歡.嗜酸乳桿菌生物學(xué)特性及其發(fā)酵乳的研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2002，30（5）：37-39.

［10］Rasic JL，Vujicic LF，Skringer M，et al.Assimilation of cholesterolby some culture oflactic acid bacteria and Bifidobacteria［J］.Biotechnology Letters，1992，14：39-44.

［11］張以芳，夏鳳毅，劉旭川.乳餅制品中乳桿菌分離鑒定及其發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，1999，27（3）：22-24.

［12］趙瑞香，李元瑞，孫俊良，等.嗜酸乳桿菌在模擬胃腸環(huán)境中抗性的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（2）：35-38.

［13］SANDER M E，WALKER D C，WALKER K M.Performance of commercial cultures in fluid milk application［J］.Journal of Dairy Science，1996，79：943-955.

Study on the growth characteristics and physiological functions of Lactobacillus casei JH-23 having monoamine oxidase-inhibitory effect

WANG Hao1，GUO Ben-heng2，*，WANG Yin-yu2，WU Zheng-jun2
（1.Food College of Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Technology Center of Bright Dairy Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

The partial growth characteristics and physiological functions of Lactobacillus casei JH-23 having monoamine oxidase-inhibitory effect were investigated in this study as a research object.The cells were Grampositive，rod-shaped and nonsporeforming.The optimal temperature，pH value and inoculum size of the bacterium were 37℃，6.0 and 3%respectively.The viable cell concentration of L.casei JH-23 could reach 1.11×109cfu/mL in MRS medium after 24h fermentation.ln the skim milk medium，the preservation property of JH-23 was favorable.The experimental results of physiological functions indicated that survival rate of L.casei JH-23 was 65.32%after growing for 3h in pH3.0 circumstance，while JH-23 presented high tolerance towards bile salt and NaCl，namely 0.5%and 6%respectively.lt was revealed that L.casei JH-23 possessed great industrial application value and development potential as a probiotic.

Lactobacillus casei JH-23；growth characteristics；physiological functions

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0168-04

2009-09-27 *通訊聯(lián)系人

王豪（1984-），男，碩士研究生，主要從事乳品微生物研究。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃“十一五”奶業(yè)重大專項(xiàng)（2006BAD04A14）。