動物性食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測研究進(jìn)展

祝偉霞,劉亞風(fēng),梁 煒

(河南出入境檢驗檢疫局,河南鄭州 450003)

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物[1],是一類具有潛在致癌和誘導(dǎo)有機(jī)體產(chǎn)生突變的物質(zhì)。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮(圖1)[2-3]。硝基呋喃類藥物常用于治療和預(yù)防沙門菌、大腸埃希菌感染引起的豬、魚、禽類消化系統(tǒng)感染。該類藥物半衰期很短,在動物體內(nèi)能迅速代謝[4],與蛋白結(jié)合的代謝物能產(chǎn)生穩(wěn)定的殘留,常用的食品烹飪方法如蒸煮、烘烤和微波加熱等均無法使代謝物降解[5]。Chu P S等[6]研究鯰魚口服呋喃類藥物時發(fā)現(xiàn),其代謝物在56 d后檢測還呈陽性。采用同位素標(biāo)記對呋喃唑酮的毒性進(jìn)行研究,證明該藥具有致癌和致基因突變性,蛋白結(jié)合態(tài)的呋喃唑酮代謝物含有3-氨基-2-唑酮的完整側(cè)鏈,在胃液的弱酸條件下,側(cè)鏈可以從結(jié)合態(tài)的母體分子中解離,水解為具有致癌性的基團(tuán)β-羥乙基肼[7]。

歐盟2377/90/EEC已全面禁止呋喃類抗菌藥物作為生長劑和殺菌劑用在動物飼料中,歐盟要求以代謝物為目標(biāo)分析物,檢測硝基呋喃原藥殘留,并要求方法靈敏度要達(dá)到1μg/kg[8],同時歐盟1756/2002/EC也禁用了新發(fā)現(xiàn)的呋喃類藥物硝呋索爾。2002年我國出口到歐盟的蝦查出硝基呋喃陽性,歐盟通報所有出口國檢測呋喃類藥物[9],中國、美國、日本也相繼禁止在食用動物中使用呋喃類藥物作為生長劑和殺菌劑,方法檢出限要求達(dá)到0.5μg/kg[10]。為了應(yīng)對“綠色壁壘”的挑戰(zhàn),本文全面綜述了目前硝基呋喃類代謝物殘留檢測的樣品前處理方法、儀器測定方法及呋喃西林假陽性的問題。

1 樣品前處理

1.1 樣品水解和衍生化

硝基呋喃類抗生素在動物體內(nèi)代謝快,半衰期短。血漿、尿不能用于呋喃類代謝物檢測,一般選用禽肉、雞蛋、肝臟等動物性食品為檢測對象,原藥代謝后以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機(jī)體組織中,根據(jù)試驗?zāi)康目煞譃橄趸秽x物總量和結(jié)合態(tài)代謝物檢測。Conneely A等[11]測定結(jié)合態(tài)呋喃唑酮代謝物時樣品先用甲醇、水、乙醇、乙醚洗滌,以除去游離態(tài)代謝物。結(jié)合態(tài)代謝物只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下才能釋放出來,硝基呋喃檢測中常用稀鹽酸溶液解離結(jié)合態(tài)代謝物。4種硝基呋喃代謝物分子質(zhì)量均在75 g/mol～201 g/mol[12],進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定時必須進(jìn)行衍生化,衍生化是為了增加分子質(zhì)量,使化合物不在高噪音背景下,增加特征碎片離子的選擇性[3],提高質(zhì)譜響應(yīng)。常采用2-硝基苯甲醛(2-NBA)衍生化氨基增加代謝物的離子化效率,水解后生成硝基苯衍生物,衍生化一般在37℃過夜進(jìn)行,親核基團(tuán)R-NH2酸性催化環(huán)境很快游離出來與2-NBA碳?；l(fā)生化學(xué)作用。

M ottier P等[8]在雞肉中添加5μg/kg硝基呋喃代謝物進(jìn)行衍生化時發(fā)現(xiàn) 1-氨基-2-內(nèi)酰腺(AHD)和氨基脲(SEM)最穩(wěn)定,而 3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)和 5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)損失40%。Leitner A等[13]等采用不同衍生化試劑對代謝物衍生化效率及穩(wěn)定性進(jìn)行比較,結(jié)果表明,2-NBA是呋喃類代謝物最有效的衍生化試劑,衍生化效率大于70%。李耀平等[14]建立在親核加成反應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)上,采用新衍生劑2-氯苯甲醛衍生硝基呋喃代謝物,提高了靈敏度,縮短了衍生反應(yīng)時間。

圖1 4種硝基呋喃原藥、代謝物、衍生物結(jié)構(gòu)式Fig.1 The stuctu res of four nitrofu rans inc luding medicines,m atabolites,derivates

1.2 液液萃取凈化

呋喃類液液萃取一般是在pH 6～7水溶液與乙酸乙酯進(jìn)行兩相分配[15-16],在液液萃取操作過程中,樣品溶液的pH對萃取效率有很大的影響,丁濤等[17]試驗不同pH對回收率的影響,發(fā)現(xiàn)pH為7～7.5時,AHD、AOZ、SEM 和AMOZ代謝物的衍生產(chǎn)物提取效率最高,分別為92.1%、95.1%、91.4%和94.3%。液液萃取易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,特別對含高蛋白、高脂肪、高淀粉的樣品,需要加入冗長的去乳步驟,延長了試驗操作時間。

1.3 固相萃取凈化

為了更有效地凈化動物源性食品中硝基呋喃類代謝物,常采用陰離子交換混合機(jī)理柱(MAX)、聚苯乙烯-二乙烯苯柱(LiChrolut EN)和親水-親脂平衡料固相萃取柱(HLB)凈化樣品[1-2,18],利用pH 7時分子間π-π作用力保留硝基芳香化合物,有機(jī)溶劑如乙酸乙酯或甲醇破壞這種作用力而洗脫被測物,Conneely A等[11]分別試驗了溶液pH為3、6和10時H LB小柱凈化時的回收率,數(shù)據(jù)表明pH 6時HLB柱回收率最高。林黎明等[1]評價了 MAX與HLB串聯(lián)柱、LiChrolut EN柱、HLB柱凈化時的回收率,最后得出H LB柱與EN柱獲得相同的回收率。

2 檢測方法

呋喃類結(jié)構(gòu)化合物紫外吸收不明顯,因此在紫外檢測時靈敏度很低,不能滿足代謝物0.5μg/kg限量要求;同時毛細(xì)管電泳和薄層色譜因其靈敏度低,在呋喃類代謝物檢測中應(yīng)用很少[3,19],其代謝物殘留檢測常用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法。

2.1 液質(zhì)聯(lián)用

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時利用了液相色譜較強(qiáng)的分離能力與質(zhì)譜檢測器豐富的結(jié)構(gòu)信息,為目標(biāo)化合物提供了可靠的定性和定量結(jié)果。由于硝基呋喃類藥物代謝物具有較低的離子化效率并缺少特征離子,2-NBA衍生物增加了相對分子質(zhì)量,提高了離子化效率。歐盟EEC/657/2002指令規(guī)定對于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個確證點。在串聯(lián)質(zhì)譜分析時,檢測1個母離子和2個子離子能達(dá)到4個確證點的要求。液質(zhì)聯(lián)用測定呋喃類代謝物液相分離時流動相中常用有機(jī)溶劑(甲醇,乙腈)與弱酸(甲酸,乙酸,甲酸銨,乙酸銨)的混合液。正離子時加入酸能促使目標(biāo)物的離子化,增強(qiáng)檢測靈敏度。目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用已用于測定動物組織[1,8,11,13]、牛奶[12]、禽組織[10,16]、雞蛋[5,15]、鯰魚[6]、蜂王漿[17]、蜂蜜[2]等動物性食品基質(zhì)中硝基呋喃類代謝物殘留量,檢出限在0.1μg/kg～2μg/kg[20]。

2.2 酶聯(lián)免疫

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的技術(shù),常作為篩選方法用于殘留分析中。該方法能快速、簡單地測定1種硝基呋喃代謝物殘留,靈敏度取決于制備抗體的選擇性。Vass M等[21]采用ELISA快速測定雞蛋中呋喃西林代謝物,樣品經(jīng)酸衍生化后酶聯(lián)免疫反應(yīng),方法EEC/657/2002驗證,檢出限(CCα)0.13 μg/kg,定量限(CCβ)0.3 μg/kg,回收率在77.8%～110%,陽性測定結(jié)果與液質(zhì)比較,表明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確;Chang C等[22]采用ELISA測定可食性動物組織呋喃唑酮代謝物時以苯甲醛作為衍生化試劑,生成苯AOZ的衍生物進(jìn)行檢測,回收率55.8%～99.6%。Pim pitak U等[23]采用ELISA測定蝦中AMOZ,檢出限為0.16μg/kg。

3 SEM假陽性問題

近年來,SEM陽性檢出率越來越高,在被檢出的呋喃類陽性結(jié)果中47%是SEM陽性,研究發(fā)現(xiàn),SEM的污染來自三種不同渠道[24],即呋喃類獸藥殘留、卡拉膠和偶氮二甲酰胺。卡拉膠常用作食品穩(wěn)定劑和稠化劑,是紅海藻中萃取出的一種多聚糖;偶氮二甲酰胺常作為發(fā)泡劑和面粉添加劑用于食品中,SEM也是偶氮二甲酰胺的一種降解產(chǎn)物,2005年歐盟已禁止其作為發(fā)泡劑用于食品。

4 硝基呋喃類藥物檢測存在問題及展望

目前動物性食品中硝基呋喃類藥物檢測存在著樣品前處理繁瑣,試劑用量大,檢測儀器昂貴,SEM

陽性率高等問題。呋喃類檢測的研究重點是在不需要衍生化步驟的情況下,直接檢測其代謝物來減少分析時間和成本。呋喃類藥物殘留研究的另一方向是建立快速ELISA法,但目前商品化試劑盒只有單克隆抗體,若成功開發(fā)出4種呋喃類藥物的抗體檢測試劑盒,則能使硝基呋喃代謝物檢測達(dá)到簡便、快速、成本低廉、特異性強(qiáng)的目的。

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