豬胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測方法的建立

馬曉平,曹三杰,文心田,肖國生,楊 利,陳華美,張雪峰

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物傳染病與基因芯片實驗室,四川省動物疫病與人類健康重點實驗室,四川雅安 625014)

豬傳染性胸膜肺炎(Infectious p leuropneumonia of sw ine,IPPS)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus p leuropneumonia,App)引起的一種以胸膜炎、肺炎和肺臟的充血、出血、壞死以及纖維素性黏連為特征的傳染病,患豬表現(xiàn)為高度呼吸困難,因急性敗血癥而突然死亡;感染后存活的育肥豬生長緩慢,平均日增重下降,飼料報酬低,耐過種豬因帶菌往往成為潛在的傳染源[1-2]。該病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疾病之一,及時、快速、準確地診斷該病以便采取相應的措施,是成功控制該病的關(guān)鍵[3]。對該病的診斷有血清學方法和病原學方法,A pp共有15個血清型,而且各型之間沒有很好的交叉反應,因而影響血清學方法檢出的準確性[4-5]。病原學方法主要采用細菌分離培養(yǎng),再通過培養(yǎng)特性和一系列的生化特性進行鑒定,費時費力。這些傳統(tǒng)的診斷方法或準確性較差,或費時費力,常延緩對該病的準確診斷,耽誤疫情的控制,造成嚴重損失。因此,建立一種靈敏度高、特異性好、快速準確的診斷方法已成為迫切的需要。

國內(nèi)外科技工作者在建立的PCR方法中主要以APXⅣ基因序列和OLMA基因序列設計引物,也取得了很好的效果[6-8],但以dsbE-like基因序列設計引物建立的PCR方法還未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 標準菌株App 1-4、App 6-10型;豬多殺性巴氏桿菌標準菌株(5:A和6:B型;大腸埃希菌(K 88株)和鏈球菌(Ⅱ型)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物傳染病與基因芯片實驗室保存。

1.1.2 分離菌株 重慶某豬場分離菌株,編號為MC、ME和MH。經(jīng)血清學鑒定為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)。

1.1.3 培養(yǎng)基 PPLO培養(yǎng)基購自北京天壇生物制品有限公司(批號:040508);月示蛋白胨(批號:20030525)、胰蛋白胨(批號:20030425)和大豆胨(批號:20030522)均為北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司生產(chǎn);NAD(批號:20031217)為Sigm a公司產(chǎn)品;供體馬血清(EQUINE SERUM DEFINED,批號:SH 30074.02)為Sigma公司產(chǎn)品;微量生化實驗試管購自杭州天和微生物試劑有限公司;TSA培養(yǎng)基、兔血巧克力培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等。

1.1.4 主要試劑 Taq(5 U/μL)、dNTPs、MgCl2、10×PCRbu ffer(Mg2+)MgCl2(25mmol/L)、2 000 bp DNA Ladder M arker均購自寶生物工程(大連)有限公司(批號:20041023)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)已發(fā)表的dsbE-like基因序列,應用Oligo(7.0)設計一對特異性引物,引物 為 :App dsbE-2L:5′-GCTTCCA TACTTGCCTTATTCG-3′;AppdsbE-2R:5′-TCGGTTGATCGGAATAGGTAAG-3′。由北京三博遠志生物科技有限公司合成,用ddH2O按25μmol/L稀釋,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株培養(yǎng) 各菌株接種于含有0.1mL/L NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和100 mL/L馬血清的PPLO液體培養(yǎng)基,37℃200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.3 基因組DNA的提取 將豬胸膜肺炎放線桿菌標準菌株、分離株、大腸埃希菌(K 88)、巴氏桿菌(5:A)純培養(yǎng)菌液10 000 r/min離心5 min,棄上清液,用無菌水溶解沉淀后,沸水中水浴10 min后冰浴冷卻,10 000 r/min離心5min,取上清液為制作模板[7-8]。

1.2.4 PCR 擴增 5μL 10×PCR buffer、4μL 25 mmol/L MgCl2、4 μL 2.5 mmol/LdNTPS、25μmol/L上下游引物各1 μL、0.3 μL 5 U/μL Taq酶、5μL模板、29.7μL無菌水,總體積為 50μL。PCR反應條件為:94℃變性4 min;94℃35 s,60℃35 s,72℃35 s,35個循環(huán)后72℃延伸10 min;4℃保存。

1.2.5 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 取6μL擴增產(chǎn)物和5μL 2 000 bp DNA Ladder M arker,在含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠板的點樣孔中點樣,電壓50 V,電流400 mA,電泳50min,以凝膠成像系統(tǒng)分析擴增結(jié)果。

1.2.6 特異性試驗 分別用上述方法制備App、大腸埃希菌、巴氏桿菌和鏈球菌標準菌株的模板,以建立的檢測方法分別進行PCR擴增,驗證建立的PCR檢測App方法的特異性[9]。

1.2.7 敏感性試驗 將App標準菌株接種PPLO液體培養(yǎng)基,37℃水浴振蕩培養(yǎng)24 h,以平板計數(shù)法測定細菌濃度。將菌液1～10-10稀釋后,制備模板,分別取1μL摸板進行PCR擴增,檢驗PCR檢測方法的敏感性。

1.2.8 重復性試驗 對App 1-4、App 6-10型標準菌株,分別進行5次PCR擴增,檢驗PCR方法的重復性。

1.2.9 PCR對分離株的檢測 分別制備了A pp分離菌株的DNA摸板,以建立的檢測方法分別進行PCR擴增。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測App的特異性試驗

經(jīng)PCR擴增,App標準株(血清1-4,6-10型)均能擴增出大小約374 bp大小的DNA特異性片段;而豬巴氏桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌的擴增結(jié)果均為陰性(圖1和圖2)。特異性試驗結(jié)果表明試驗建立的PCR檢測App的方法具有特異性。

2.2 敏感性試驗

建立的PCR檢測App敏感性試驗結(jié)果表明,該方法對App菌液最低檢出濃度為71 cfu/mL。

2.3 重復性試驗

對App 1-4、A pp 6-10型標準菌株,分別進行5次PCR擴增,均能夠擴增出目的DNA條帶,試驗結(jié)果表明建立的App PCR檢測方法具有較好的檢測重復性。

2.4 分離株的檢測

PCR檢測方法對試驗分離的MC、ME、MH株進行了檢測,均可擴增出大小約374 bp的DNA條帶(圖3),表明建立的PCR檢測方法用于分離App菌的檢測。

3 討論

試驗參考Chiers K等[10]介紹的方法,設計了一對可擴增374 bp片段的特異性引物。成功的從9個標準株和3個分離株中擴增出特異性的目的DNA片段,而巴氏桿菌、大腸埃希菌和鏈球菌均為陰性,對App菌液最低檢出濃度為71 cfu/mL。表明本檢測方法對App具有特異性和敏感性。

在PCR反應體系中,模板DNA的用量可以在1μL～10μL之間變化,這取決于細菌的濃度[11];本試驗用煮沸法制備模板[11],比用其他方法制備模板簡單、快捷,但沸水中水浴后一定要離心,否則會有“拖尾”現(xiàn)象出現(xiàn)。

建立的PCR診斷方法,避免了血清學方法可能產(chǎn)生的交叉反應現(xiàn)象。但是PCR作為一種病原學診斷方法均有自身的局限性[12-13]。本方法雖能檢測出所有的血清型,但不能將菌株分型[14]。只有把病原學和血清學方法結(jié)合起來,才能對本病的血清型做出確切的診斷[15-16]。

國內(nèi)外已經(jīng)建立了很多以A pp、ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ以及Omp等某一DNA片段為目的基因的PCR診斷方法。但是與App相近的一些種屬也存在著這些目的基因或者是差別極小,在進行PCR擴增的時候,可能會出現(xiàn)假陽性,造成誤診[5,11,17]。

[1]馬曉平,彭廣能,曹三杰,等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌病的初步分離鑒定與診治體會[J].中國獸醫(yī)雜志,2008,44(2):75-76.

[2]楊旭夫,彭發(fā)泉.我國豬胸膜肺炎嗜血桿菌感染的確定和診斷[J].畜牧獸醫(yī)學報,1990,21(3):243-245.

[3]徐公義,王海麗,葛長城,等.魯西地區(qū)豬胸膜肺炎放線桿菌流行病學調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(13):6002-6004.

[4]馬曉平,曹三杰,文心田.豬傳染性胸膜肺炎病原特性及其診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2005,26(5):6-9.

[5]Gram T,Ahrens P.Im proved diagnostic PCR assay for Actinobacillus p leuropneumoniae based on the nucleotide sequence of an outer memb rane lipoprotein[J].JC linical M icrobiol,1998,36(2):443-448.

[6]陳華美,曹三杰,文心田,等,豬傳染性胸瞑肺炎放線桿菌Om-LA-PCR檢測方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2009(3):79-80.

[7]刁有祥,丁家波 ,姜世金 ,等.豬胸膜肺炎放線桿菌 PCR診斷方法的建立與應用[J].中國獸醫(yī)學報,2006,26(4):379-381.

[8]冼瓊珍,葉潤全,顧萬軍,等.豬胸膜肺炎放線桿菌 PCR檢測方法的建立及臨床應用[J].中國獸醫(yī)科學,2007,37(2):117-l20.

[9]馮元璋,馬 萍,周碧君,等.胸膜肺炎放線桿菌的 PC R診斷方法研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報,2008,27(1):75-79.

[10]Chiers K,Van Overbeke I,Donne E,et al.Detection of Actinobacillus p leu ropneumoniae in cultures from nasal and tonsillar swabsof pigsby a PCR assay based on the nucleotide sequence of a dsbE-like gene[J].Vet M icrobiol,2001,83(2):147-159.

[11]陸杏華,何后軍,王 萍,等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌江西株的分離鑒定及 PCR診斷[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(6):2231-2232.

[12]龐耀珊,謝芝勛,劉加波,等.二溫式PCR檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌方法的建立與應用[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2006,37(2):203-205.

[13]王牟平,劉思國,王春來,等.豬傳染性胸膜肺炎 PCR診斷方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報,2003,25(4):305-309.

[14]馮元璋,馬 萍,周碧君,等.胸膜肺炎放線桿菌的PC R診斷方法研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報,2008,27(1):75-79.

[15]G ram T,Ah rens P,A ndreasen M,et al.An Actinobacillus p leuropneumoniae PCR typing system based on the apx and omLA genes--evaluation of isolates fromLungs and tonsils of pigs[J].Vet M icrobiol,2000,75(1):43-57.

[16]賀 英,趙 萍,儲岳峰,等.復合PCR鑒定胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌方法的建立及初步應用[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報,2009,31(1):13-16.

[17]吳秀芬,楊煥民,李 鵬.聯(lián)PCR檢測豬胸膜肺炎放線桿菌和豬巴氏桿菌[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2007(3):82-83.