電針對(duì)模型大鼠海馬CA1區(qū)Aβ的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)和腦內(nèi)SOD活性的影響

趙鳳云，關(guān)珊珊，張鵬，姜國(guó)華

(1.黑龍江省康復(fù)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150018;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以老年人為多發(fā)，是癡呆最常見(jiàn)的病因。以老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬椎體細(xì)胞顆?？张葑冃院蜕窠?jīng)元缺失為典型病理特征，是伴隨老化而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙為主的疾患。針灸對(duì)癡呆具有一定的療效，對(duì)老年癡呆患者的智能提高(改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙)及臨床癥狀改善均有明顯的作用［1～3］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

4月齡Wistar大鼠60只(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，健康清潔級(jí)，體重220～250g，鏈脲霉素(STZ)、丙二醛、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Aβ免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組、造模及行為學(xué)測(cè)試

將Wistar大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，然后用Morris水迷宮篩選出智力正常的60只大鼠，隨機(jī)分成空白組12只、模型對(duì)照組12只、模型組12只、西藥組12只和電針組12只。模型組、西藥組和電針組的大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3mL·kg－1)腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上。常規(guī)消毒頭頂部皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜后用錐顱器鉆開(kāi)顱骨，暴露硬腦膜，參照大鼠腦立體定位圖譜［1］定位側(cè)腦室:前囟后0.8mm，中線旁開(kāi)1.5mm，深3.8mm。用微量注射器在每側(cè)側(cè)腦室各注射鏈脲霉素(STZ)10μL(注射前將STZ 溶于生理鹽水，濃度為 10%)［5，6］，緩慢進(jìn)針，勻速給藥，10min注完，使其充分浸潤(rùn)局部組織，緩慢拔出微量注射器，第3天重復(fù)注射，劑量同前。正常組不予處置，模型對(duì)照組操作同前，以等量生理鹽水替代STZ。所有術(shù)后大鼠均肌注青霉素，每只每天40萬(wàn)單位，常規(guī)飼養(yǎng)。水迷宮行為學(xué)測(cè)試分別在術(shù)前、術(shù)后及治療后進(jìn)行。①定位航行試驗(yàn):歷時(shí)5d，每天(上午7點(diǎn)30至下午16點(diǎn))4次水迷宮測(cè)試，將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其在120s內(nèi)找到平臺(tái)并爬上平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期。如果大鼠在120s內(nèi)不能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其至平臺(tái)。第1d讓大鼠在平臺(tái)上停留20s，第2d停留15s，第3d停留10s，第4天停留5s。②空間探索實(shí)驗(yàn):第5d去除平臺(tái)，任選一入水點(diǎn)，將大鼠放入水池中，記錄其在120s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)所在位置的時(shí)間。

1.3 治療及取材

正常組、模型對(duì)照組、模型組常規(guī)飼養(yǎng)。西藥組給與氫溴酸加蘭他敏，劑量為0.5～1mg·(kg·d)－1。電針組針刺治療，根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》，用0.25mm×25mm毫針針刺百會(huì)穴，平刺約2.5mm;大椎穴，直刺約4mm;雙側(cè)太溪穴，直刺進(jìn)針3mm;雙側(cè)腎俞穴，直刺進(jìn)針5mm;雙側(cè)足三里穴，直刺進(jìn)針4mm。其中百會(huì)穴、大椎穴連接KWD－808Ⅱ型全能脈沖電療儀，頻率為30Hz，電壓為2V，強(qiáng)度以肢體輕微抖動(dòng)為度;余穴間歇5min捻轉(zhuǎn)1次，平補(bǔ)平瀉，每日1次，時(shí)間30min，7d為1療程，間歇1天，治療4個(gè)療程后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。水迷宮測(cè)試完畢后，第2d每組隨機(jī)選取6只，用10%水合氯醛(4mL·kg－1)腹腔麻醉，麻醉后立即開(kāi)胸暴露心臟，左心室插管，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速灌注生理鹽水至肝臟顏色變白，改灌4%的多聚甲醛，快速灌注，當(dāng)出現(xiàn)下肢抽動(dòng)時(shí)，緩慢灌注30min，至肝臟變硬，四肢、尾均僵硬后停灌。取腦，放入4%的多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜，進(jìn)行石蠟包埋，HE染色，免疫組織化學(xué)染色。再將每組剩余大鼠斷頸處死取全腦，取一側(cè)腦組織，去除軟腦膜血管、腦干及小腦，用冰生理鹽水沖洗血液后，濾紙拭干，稱(chēng)重，加入9倍冷生理鹽水，電動(dòng)勻漿機(jī)中研磨成10%勻漿，之后以3000r·min－1的速度離心15min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)方法

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的計(jì)算:取每組大鼠腦組織切片12張，每張切片于海馬區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，在400倍顯微鏡下計(jì)算此區(qū)域內(nèi)的免疫組化染色為棕色的Aβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。由兩名人員獨(dú)立觀察最后取平均值，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。計(jì)算公式:

圖像采用Image－Proplus5.0軟件進(jìn)行圖像分析。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)程序軟件SPSS 17.0進(jìn)行運(yùn)算，采用t檢驗(yàn)，用(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)Aβ蛋白表達(dá)

表1顯示，正常組、模型對(duì)照組CA1區(qū)Aβ蛋白有較低表達(dá)，模型組CA1區(qū)Aβ蛋白表達(dá)水平顯著升高，治療后西藥組、電針組與模型組比較有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組海馬CA1區(qū)Aβ蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)(個(gè)·mm－2)

表1 各組海馬CA1區(qū)Aβ蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)(個(gè)·mm－2)

注:與模型組比較，*P<0.01。

組別 n 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)正常組 12 10.87±3.15*模型對(duì)照組 12 11.09±3.28*模型組 12 25.31±2.46西藥組 12 18.52±2.63*電針組 12 17.94±2.70*

2.2 電針對(duì)AD大鼠腦組織內(nèi)MDA含量和SOD活性的影響 見(jiàn)表2，圖1。

圖1顯示:模型組與正常組、模型對(duì)照組比較，大鼠腦組織內(nèi)MDA含量明顯升高(P<0.01);電針組、西藥組與模型組比較，MDA含量明顯降低(P<0.01);模型組與正常組、模型對(duì)照組比較，SOD活性明顯降低(P<0.01);電針組、西藥組與模型組比較，SOD活性明顯升高(P<0.01)，均有極顯著性差異。以上說(shuō)明電針可以降低AD大鼠腦組織內(nèi)MDA含量，而使SOD活性增強(qiáng)。

表2 各組大鼠腦組織內(nèi)MDA含量和SOD活性(±s)

表2 各組大鼠腦組織內(nèi)MDA含量和SOD活性(±s)

注:與模型組比較，*P<0.01;與正常組、模型對(duì)照組比較，#P<0.01;與西藥組比較，▲P>0.05。

組別 n MDA(nmol·mgprot－1) SOD(NU·mgprot－1)11 217.52±15.07 204.35±11.18模型對(duì)照組 10 219.73±14.87 201.51±12.36模型組 10 310.22±5.42# 121.25±8.27#西藥組 9 242.47±9.65* 171.31±7.71*電針組 10 268.36±11.09*▲ 168.58±10.06正常組*▲

圖1 各組大鼠腦組織內(nèi)MDA含量和SOD活性比較

3 討論

AD最典型的病理改變是老年斑，而老年斑主要成分就是Aβ。聚集狀態(tài)的Aβ具有長(zhǎng)期的穩(wěn)定性，所以一旦發(fā)生聚集，很快就形成極難溶解的沉淀，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)沉積下來(lái)。沉積的Aβ與凋亡細(xì)胞在腦內(nèi)如基底核、海馬、新皮層等逐漸累積，進(jìn)而導(dǎo)致典型的老年斑。纖維狀的Aβ產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，從而使AD患者出現(xiàn)認(rèn)知功能減退與記憶礙障等癡呆癥狀。脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物如MDA的細(xì)胞毒性作用，是導(dǎo)致AD神經(jīng)元變性壞死的重要原因。SOD能夠阻滯由于大量過(guò)氧化氫蓄積所導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用，SOD是體內(nèi)重要的自由基清除酶，能促使超氧陰離子氧化為過(guò)氧化氫，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，衰老機(jī)體SOD活性減弱，抗氧化劑減少，自由基損傷因素增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠與正常組和模型對(duì)照組對(duì)比，可見(jiàn)到較多的Aβ沉積，其腦內(nèi)Aβ陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組和模型對(duì)照組。電針治療后，電針組大鼠Aβ的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯下降;模型組與正常組、模型對(duì)照組比較，大鼠腦組織內(nèi)MDA含量明顯升高;電針組、西藥組與模型組比較，MDA含量明顯降低;模型組與正常組、模型對(duì)照組比較，SOD活性明顯降低(P<0.01);電針組、西藥組與模型組比較，SOD活性明顯升高(P<0.01)，均有極顯著性差異。根據(jù)阿爾茨海默病臨床表現(xiàn)，在中醫(yī)學(xué)中將其歸屬為“癡呆”、“健忘”、“善忘”、“呆病”、“郁證”，“癲疾”等病癥范疇，針刺治療AD的原則是補(bǔ)腎益髓、醒神開(kāi)竅。補(bǔ)腎益髓以治其本，醒神開(kāi)竅以治其標(biāo)。在上述治療原則的指導(dǎo)下，選取百會(huì)、大椎、腎俞、太溪和足三里穴。百會(huì)穴為督脈和足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的交會(huì)穴，具醒神開(kāi)竅之功，為治療老年性癡呆的主要穴位;腎俞為足太陽(yáng)膀胱經(jīng)穴，培補(bǔ)腎氣;太溪為足少陰腎經(jīng)穴，補(bǔ)腎益精，二者為臨床補(bǔ)腎要穴，常用于失眠，健忘及其它神志及精神疾患;大椎出自《素問(wèn)·氣府》，屬督脈經(jīng)穴位，是手足六陽(yáng)經(jīng)的交會(huì)穴，為“諸陽(yáng)之會(huì)”，可通調(diào)諸經(jīng)，增強(qiáng)各臟腑經(jīng)絡(luò)，促使陰陽(yáng)平衡;足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴，是傳統(tǒng)保健要穴，且在《素問(wèn)·玉機(jī)真臟論》指出:“五臟者，皆稟氣于胃，胃者，五臟之本也”，故而分別用來(lái)補(bǔ)先天之本和后天之本。諸穴相配，達(dá)到補(bǔ)腎益髓、醒神開(kāi)竅、標(biāo)本同治的目的。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，電針能夠抑制Aβ在腦內(nèi)過(guò)度沉積，降低Aβ在腦內(nèi)的表達(dá)，降低腦組織內(nèi)MDA含量，而使SOD活性增強(qiáng)，從而改善了大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。從實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證了電針對(duì)AD的治療效果。

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