蝙蝠葛酚性堿對(duì)胰腺癌瘤組織中K－ras蛋白表達(dá)的影響

馮大志，白云，聞喜英，王家明，蘇云明

(1.哈藥集團(tuán)制藥六廠，黑龍江 哈爾濱 150025;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)藥，黑龍江 牡丹江 157009;4.哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150010)

胰腺癌的發(fā)病率有明顯的地區(qū)差異，在發(fā)達(dá)國家和工業(yè)化程度較高的國家，其發(fā)病率較高，而非洲和亞洲國家的發(fā)病率較低。半個(gè)多世紀(jì)來，英、美等國家的發(fā)病率逐步上升。胰腺癌居常見癌癥死因的第4位，居消化道癌癥死因的第2位，僅次于大腸癌［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)胰腺癌的病因研究尚未完全清楚，可能與胰腺癌發(fā)病的有關(guān)因素包括吸煙、高熱量、高膽固醇、高碳水化合物攝入性飲食、慢性胰腺炎、糖尿病、胃潰瘍和胃切除術(shù)、膽囊切除術(shù)和膽石癥、環(huán)境污染、遺傳因素(包括家族性胰腺癌、Ⅰ型多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征、遺傳性胰腺炎、Ⅱ型Lynch綜合征、共濟(jì)失調(diào)－毛細(xì)血管擴(kuò)張綜合征、家族性非典型性多發(fā)性痣黑素瘤綜合征等)。目前研究認(rèn)為，癌基因和抑癌基因(如K－ras、DPC4、P16、P53 等)、細(xì)胞凋亡、端粒酶、腫瘤新生血管的形成等在胰腺癌的發(fā)生中起重要作用［2］。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

裸鼠48只，體重(20±2)g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，合格證:SCXK(京)2007－0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)瘤株

胰腺癌瘤株(BXPC－3)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)

在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心飼養(yǎng)。

1.4 藥物

蝙蝠葛酚性堿(PAMD)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王棟教授提供，用時(shí)先以1moL·L－1HCl溶解后，再用1moL·L－1NaOH調(diào)pH值至中性，加蒸餾水至所需濃度。實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)配制成溶液。

注射用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide For Injection)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H32020857。

1.5 儀器及試劑

①低溫冰箱(MDF－U50V型)，日本三洋;②電子天平AL204，METTLEY TOLEDO英國;③超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠;④電泳凝膠圖象分析系統(tǒng)，Backman公司;⑤PVDF膜:美國Pall公司;⑥NC膜:美國PALL公司;⑦濾紙:Whatman 3mm;⑧麗春紅:武漢博士德;⑨封閉用脫脂乳:sigma公司;⑩抗體:santa公司 baction(sc－47778)k－ras(sc－30)HRP羊抗兔二抗:sigma公司;⑩超敏發(fā)光液:鑫豐生物材料公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 胰腺癌BXPC－3裸鼠模型的建立

取凍存的胰腺癌細(xì)胞株BXPC－3，立即投入37℃水中，1min內(nèi)融化，然后離心去除凍存液，用約10倍的冷RPMI1640完全培養(yǎng)液洗1次，接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液。腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)在RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中，隔日換液，細(xì)胞長成單層后，用0.25%胰酶EDTA消化、傳代。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，收集細(xì)胞并用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整濃度為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液備用，接種于40只裸鼠右腋窩皮下，每只鼠接種0.2mL(約含瘤細(xì)胞數(shù)1×106個(gè))。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

40只裸鼠造模24h后隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為PAMD高、中、低劑量組，模型組對(duì)照組，陽性對(duì)照組。另取8只裸鼠作為空白對(duì)照組(不接種瘤株，給予同體積的生理鹽水)。

2.3 給藥劑量及給藥途徑

實(shí)驗(yàn)組每日給藥劑量為PAMD高劑量20mg·kg－1，PAMD 中劑量 10mg·kg－1，PAMD 低劑量 5mg·kg－1，模型組及空白對(duì)照組每日給予同等容積生理鹽水，環(huán)磷酰胺對(duì)照組給予注射用環(huán)磷酰胺156mg·kg－1(每周給藥1次)。實(shí)驗(yàn)各組均采用腹腔注射給藥，連續(xù)用藥21d。

2.4 組織中總蛋白的提取

實(shí)驗(yàn)各組連續(xù)給藥21d(藥劑量及給藥途徑同實(shí)驗(yàn)一)后，次日摘眼球取血處死小鼠，并用酒精消毒操作部位皮膚，置于超凈工作臺(tái)中(事先以紫外線燈消毒30min)，以無菌操作剝?nèi)∧[瘤結(jié)節(jié)，剔除纖維包膜和壞死組織，標(biāo)記好放入事先準(zhǔn)備好的液氮罐內(nèi)保存。

將少量瘤組織塊置于1～2mL勻漿器中，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。加入400μL單去污劑裂解液于勻漿器中進(jìn)行勻漿。然后置于冰上，重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5mL EP管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5mL EP管中，采用蛋白印跡技術(shù)(Western－blot)檢測(cè)腫瘤k－ras蛋白表達(dá)的差異。放入顯影液中，約15s后，放入清水清洗，放入定影液中定影。

2.5 分析方法

膠片采用Alpha image 2000凝膠成像系統(tǒng)掃描，所得圖形使用Image－pro plus分析。計(jì)算各個(gè)指標(biāo)樣本的平均積分光密度(IOD)。

縱坐標(biāo)為IOD，意思是平均積分光密度(IOD)，又稱積分吸光度(IA)，為所測(cè)結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)各像素光密度值之和，即:IOD= ∑ODpixeli= ∑［log(Io/Ib)］...pixeli，為第i個(gè)像素的光密度值。積分光密度可反映所測(cè)結(jié)構(gòu)的光密度與面積的綜合變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 PAMD對(duì)胰腺癌K－ras、DPC4蛋白表達(dá)的結(jié)果見圖1，圖2。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組β－action蛋白表達(dá)

圖2 實(shí)驗(yàn)各組K－ras蛋白表達(dá)

3.2 PAMD對(duì)胰腺癌K－ras蛋白表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAMD高、中、低劑量組及陽性對(duì)照組同模型組比較，K－ras蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 PAMD對(duì)胰腺癌K－ras蛋白表達(dá)的影響(±s)

表1 PAMD對(duì)胰腺癌K－ras蛋白表達(dá)的影響(±s)

注:各給藥組分別與模型對(duì)照組比較，**P<0.01。

組別 n 給藥劑量(mg·kg－1) K－ras相對(duì)表達(dá)量(K－ras/IOD) β－actin模型組 4 等體積8.8371±0.0828 100%PAMD高劑量組 4 20.00 3.2097±0.0403** 36.32±0.0062%**PAMD中劑量組 4 10.00 4.4126±0.0663** 49.93±0.0085%**PAMD低劑量組 4 5.00 5.1310±0.0478** 58.07±0.0084%**環(huán)磷酰胺對(duì)照組 4 156.00 4.1727±0.0216** 47.23±0.0067%**

4 討論

胰腺癌是K－ras基因突變發(fā)生率最高的腫瘤，達(dá)75% ～100%［3～5］。ras基因編碼一種結(jié)構(gòu)高度相似的分子量為21kD的蛋白質(zhì)，稱為p21蛋白，K－ras基因編碼表達(dá)的產(chǎn)物是ras蛋白，其結(jié)構(gòu)與其他ras基因編碼表達(dá)的ras蛋白具有高度同源性，功能也基本相同。ras蛋白始終處于GDP結(jié)合失活和GTP結(jié)合激活兩種狀態(tài)的循環(huán)中。當(dāng)細(xì)胞外因素作用于細(xì)胞時(shí)，如EGF和EGFR結(jié)合，EGFR內(nèi)源性酪氨酸激酶被激活，自身某些特異的酪氨酸磷酸化，并與Grb2等蛋白的序列相似域2(SH2)結(jié)合，促進(jìn)Grb2等蛋白的SH3與SOS蛋白結(jié)合，使ras蛋白與GDP解離而與GTP結(jié)合，使ras蛋白活化，進(jìn)而通過一系列細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑最終促進(jìn)有關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，ras蛋白自身的三磷酸鳥苷酶(GTPase)使GTP水解為GDP，使ras蛋白又回到失活狀態(tài)。突變K－ras基因編碼的ras蛋白可發(fā)生結(jié)構(gòu)和(或)構(gòu)像變化，其內(nèi)源性GTPase活性幾乎完全喪失，使ras蛋白一直處于活化狀態(tài)，持續(xù)作用于下游各信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，增生失控，最后惡變。

目前，越來越多的學(xué)者認(rèn)為腫瘤可能是一種多基因疾病，基因治療可能是治療惡性腫瘤的有效途徑。

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