死后大鼠脾臟組織FTIR測量結(jié)果的法醫(yī)學(xué)分析

黃 平，余榮軍，李 立，柯 詠，樊拴良，王振原

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海200063；2.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，陜西 西安710061；3.寧波市公安局 刑偵支隊，浙江 寧波315040；4.復(fù)旦大學(xué) 上海醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，上海200032）

死后大鼠脾臟組織FTIR測量結(jié)果的法醫(yī)學(xué)分析

黃 平1，2，余榮軍3，李 立1，4，柯 詠2，樊拴良2，王振原2

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海200063；2.西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，陜西 西安710061；3.寧波市公安局 刑偵支隊，浙江 寧波315040；4.復(fù)旦大學(xué) 上海醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，上海200032）

目的 應(yīng)用傅里葉變換紅外（FTIR）光譜技術(shù)分析大鼠死后脾臟組織隨死亡時間增加的化學(xué)變化過程，為死亡時間推斷研究提供新的途徑與研究數(shù)據(jù)。方法 大鼠斷頸處死后，在30℃、20℃及4℃環(huán)境中，不同死亡時間點提取大鼠脾臟組織，并運用FTIR光譜儀測定不同化學(xué)基團(tuán)隨死亡時間的變化。結(jié)果 隨著死亡時間的推移，大鼠脾臟組織FTIR光譜的主要吸收峰峰位沒有明顯變化，而其吸收峰強度有明顯差異：（1）1 080 cm-1和1 238 cm-1被指認(rèn)核酸譜帶吸收峰的峰強呈下降趨勢；（2）1 541 cm-1被指認(rèn)酰胺Ⅱ吸收峰的峰強呈上升變化；（3）1 396cm-1被指認(rèn)脂肪酸吸收峰的峰強呈上升變化；（4）指認(rèn)為C-H結(jié)構(gòu)振動的2 852、2 871、2 923、2 958cm-1吸收峰的峰強呈現(xiàn)上升趨勢。結(jié)論 FTIR光譜分析技術(shù)有望成為法醫(yī)死亡時間推斷的有效方法。

傅立葉變換；紅外光譜；死亡時間；脾臟

Abstract：ObjectiveTo explore chemical changes in the rat spleen postmortem using FTIR spectroscopy and to provide a new method and research data for estimation of postmortem interval.MethodsRats were sacrificed by cervical dislocation and the cadavers were kept at 30℃，22℃-26℃ and 4℃ in a controlled environment chamber.The spleens were sub-samples at different postmortem time points.All spleen tissues were measured using FTIR spectrometer.ResultsThe absorption peak position showed no changes after death，but absorption intensity displayed obvious changes： （1）the absorption intensity assigned to nucleic acid （1080 cm-1and 1238 cm-1） showed decreasing tendency；（2）the absorption intensity assigned to amide Ⅱ（1541 cm-1）showed increasing tendency；（3）the absorption intensity assigned to fatty acid （1396 cm-1） increased.（4）the absorption intensity assigned to C-H vibration （2852，2871，2923，2958cm-1） showed increasing tendency.ConclusionFTIR spectroscopy can be an effective method for the estimation of postmortem interval.

Key words：Fourier transform；infrared spectrometry；postmortem interval；spleen

死亡時間的推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究的重點和難點之一。死亡時間的確定有利于死亡方式或死亡性質(zhì)的判斷，可為破案提供線索，縮小偵查范圍。目前國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者運用多種技術(shù)手段推斷死亡時間，但精確的推斷死亡時間仍沒有得到解決[1-4]。傅里葉變換紅外光譜 （FTIR）能準(zhǔn)確靈敏地對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相應(yīng)基團(tuán)的分子振動變化進(jìn)行檢測，且特異性高、操作簡便。構(gòu)成組織和細(xì)胞的基本物質(zhì)是蛋白質(zhì)、糖、脂肪、核酸等，因此細(xì)胞和組織紅外光譜是這幾類生物分子相互疊加的結(jié)果，紅外光譜可精確反映出其含量和構(gòu)型的變化。生物體死亡后由于細(xì)胞內(nèi)各類水解酶及腐敗菌的化學(xué)作用，生物分子含量、結(jié)構(gòu)及其化學(xué)基團(tuán)均會發(fā)生變化[5-9]。本研究以死后大鼠脾臟組織為樣本，運用FTIR光譜衰減全反射技術(shù)進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，分析其隨死亡時間的推移所呈現(xiàn)出的變化規(guī)律，從而為推斷死亡時間提供一種新的研究方法，并對現(xiàn)有的推斷方法進(jìn)行補充。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分解及取材

健康雄性SD大鼠30只（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體重240～260g。購回后于溫度20℃，濕度40%～60%，環(huán)境中飼養(yǎng)2d。脫頸椎法快速處死大鼠。分別放置于4℃、20℃、30℃的環(huán)境中。每個溫度組10只SD大鼠。放置于4℃、20℃分別于大鼠死后 0、6、12、24、48、72、96、120、144、168h 對脾臟進(jìn)行單個大鼠的多次重復(fù)取材，每次取材位置相延續(xù)。放置于 30℃大鼠在死后 0、6、12、24、36、48、60、72h 取材，單只大鼠多次取材（高溫自溶液化，有形固體組織可取材到72h）。每個死后時間點取材10mg，蒸餾水和PBS洗凈組織表面血跡，存放于2.5ml凍存管內(nèi)，立即投入液氮中保存。

1.2 光譜學(xué)測量

用乙醚擦洗ZnSe晶體，背景掃描。島津IR Solution軟件，設(shè)置紅外測量參數(shù)，分辨率為4cm-1，波數(shù)范圍400～4 000cm-1，掃描次數(shù)100次；光譜顯示吸光度模式。液氮中取出組織放置于ATR探頭ZnSn晶體表面，下壓ATR探頭上的杠桿擠壓晶體表面組織，擠壓后組織與晶體緊密相貼。電吹風(fēng)調(diào)至冷風(fēng)擋位，冷風(fēng)吹擠壓組織5min。FTIR光譜圖譜基線校正，400～4 000cm-1中所有基線處吸光度保持為0。光譜平滑設(shè)置為10。歸一化處理光譜圖，在1 647cm-1處進(jìn)行歸一化。大鼠脾臟FTIR光譜見圖1。

圖1 大鼠脾臟FTIR光譜

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件計算不同死亡時間點吸收峰峰高比，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，六種數(shù)學(xué)方程模型選擇，對吸收峰強比和死亡時間曲線擬合：線形模型、四次方模型、三次方模型、復(fù)合模型、生長模型、指數(shù)模型對死后峰強比變化進(jìn)行數(shù)學(xué)方程模擬，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20℃大鼠死后脾臟光譜學(xué)變化

大鼠脾臟 3 012、2 958、2 925、2 871、2 852、1 541、1 396 cm-1吸收峰峰強死后明顯升高，1 238、1 153、1 080 cm-1吸收峰峰強死后顯著下降。3 303、1 652、1 456、1 338、1 313、1 170 cm-1吸收峰峰強保持穩(wěn)定。選取吸收峰峰強上升和下降變化在死后24 h內(nèi)不明顯。2 958、2 925、2 871、2 852 cm-1吸收峰峰強在死后72 h要高于3 303 cm-1吸收峰峰強。1 652 cm-1、1 541 cm-1吸收峰死后出現(xiàn)小吸收峰，小吸收峰數(shù)目隨死亡時間延長而增加。1 541吸收峰峰強在72 h后高于1 652 cm-1吸收峰峰強，且1 541 cm-1吸收峰峰面積和峰寬死后有增加趨勢（見圖2）。A3012/A3303、A2958/A3303、A2925/A3303、A2871/A3303、A2852/A3303顯示出相似變化趨勢，死后24 h沒有顯著變化，各相鄰死亡時間點之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。死后24 h迅速上升至96 h后下降，此后再上升至 168 h。 A1652/A1541、A1456/A1396、A1652/A1396、A1541/A1396死后下降，A1456/A1396下降趨勢較其它三個峰強比值低。A1652/A1396、A1541/A1396死后24 h內(nèi)迅速下降，各相鄰死亡時間點有統(tǒng)計學(xué)差異。A1238/A1396、A1080/A1396死后24 h又迅速下降持續(xù)到72 h后保持穩(wěn)定到96 h，此后繼續(xù)下降到120 h，144 h～168 h再次保持穩(wěn)定（見圖3）。三次方曲線擬和在6種擬和曲線中顯示出最高擬和決定系數(shù)，A1652/A1396顯示出最高的決定系數(shù)，R2=0.926（見圖 4）。

圖2 大鼠死后脾臟不同時間點FTIR光譜

圖3 大鼠脾臟峰強比變化趨勢

圖4 大鼠脾臟峰強比的擬合曲線

2.2 4℃、30℃大鼠死后光譜學(xué)變化

環(huán)境溫度4℃，大鼠死后ATR FTIR光譜變化與20℃相比沒有顯著變化，產(chǎn)生變化吸收峰1 396 cm-1在光譜中增加，并與20℃變化趨勢保持一致。3 012、2 958、 2 925、 2 871、2 852、1 541、1 396 cm-1吸收峰峰強死后明顯升高。脾臟2 958、2 925、2 871、2 852 cm-1吸收峰峰強死后24 h高過3 303 cm-1。脾臟1 541 cm-1吸收峰峰強在死后24 h高于1 652 cm-1吸收峰。3 303、1 652、1 338、1 313 cm-1吸收峰峰強保持穩(wěn)定。死后72 h 1 541 cm-1吸收峰出現(xiàn)小吸收峰。1 652 cm-1吸收峰峰面積顯著下降，1 238、1 080 cm-1吸收峰峰強死后顯著下降。1 238、1 080 cm-1在死后60 h保持穩(wěn)定（見圖 5）。

3 討論

3.1 2 800～4 000cm-1波數(shù)范圍光譜學(xué)變化

C-H伸縮振動引起了3 030～2 800 cm-1波數(shù)區(qū)域3 012、2 958、2 925、2 852 cm-14個吸收峰均來自脂類的振動，其中3 012 cm-1為烯烴族的H-C=CH伸縮振動，來自于脂肪和膽固醇酯，可以作為檢測不飽和?；鶞y量指標(biāo)[10-11]。在大鼠ATR FTIR光譜中這些吸收峰死后增加。脂肪分子增加，大鼠死后和人離體所有組織能量代謝停止，甘油三酯酶和脂肪酸乙?；笇⑼Ｖ棺饔?，這樣組織中原有的脂肪無法分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸沒有乙酰化也無法進(jìn)行β氧化，使得體內(nèi)原有脂肪和脂肪酸含量保持不變。死后細(xì)菌在20～28℃有最佳的繁殖速度，而細(xì)菌繁殖速度是以指數(shù)形式生長，細(xì)菌會利用死后組織中的化學(xué)物質(zhì)來合成自身繁殖所需要的蛋白質(zhì)、膜脂、碳水化合物和核酸。脂肪是細(xì)胞膜、細(xì)菌細(xì)胞壁合成所必須的化學(xué)物質(zhì)，死后隨著細(xì)菌大量繁殖，脂肪含量也在迅速提高。3 012、2 958、2 925、2 852 cm-1四個吸收峰代表飽和和不飽和脂肪含量變化，它們死后增加可能證明我們的假設(shè)的正確性。但仍需要進(jìn)一步實驗研究證明細(xì)菌繁殖導(dǎo)致脂肪含量增加這一假說的正確性。

圖5 4℃、20℃、30℃ 大鼠死后72 h光譜

3.2 1 375～1 700cm-1波數(shù)范圍光譜學(xué)變化

1 652 cm-1酰胺I中C-O伸縮振動引起，1 541 cm-1是蛋白質(zhì)酰胺II中N-H彎曲振動和C-N伸縮振動產(chǎn)生[12-13]。這兩個吸收峰均有蛋白質(zhì)中分子振動產(chǎn)生，但死后經(jīng)典理論認(rèn)為蛋白質(zhì)在蛋白水解酶的作用下發(fā)生降解，使用western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)對死后組織中的各類蛋白進(jìn)行半定量研究均發(fā)現(xiàn)組織中的觀察蛋白含量減少[1-2]。A1652/A1541比值反映出酰胺I和酰胺II比值在死后和離體后的改變，1 541 cm-1吸收峰峰強在死后有上升改變，說明蛋白質(zhì)酰胺II帶分子含量在死后增加，這和死后蛋白降解的經(jīng)典理論發(fā)生了沖突。但死后組織化學(xué)變化十分復(fù)雜，它牽涉到原有物質(zhì)的降解和新物質(zhì)的生成，1 541 cm-1吸收峰增加并不是由于蛋白質(zhì)酰胺II分子增加而引起，可能是由其它含N-H、C-N有機(jī)或者無機(jī)物質(zhì)增加而導(dǎo)致的。這些未確定含N-H、C-N有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)死后合成的速度要快于蛋白質(zhì)酰胺II降解的速度。1 396 cm-1是脂肪酸COO-振動引起[14]，該吸收峰在所有的光譜均存在，而且隨著大鼠死后和人離體組織時間的延長而增加。脂肪酸是脂肪合成的必須物質(zhì)，該峰增加和3 012、2 958、2 925、2 852 cm-1四個來自脂肪增加，說明死后組織脂類物質(zhì)的增加。

3.3 900～1 300 cm-1波數(shù)范圍光譜學(xué)變化

1 238 cm-1吸收峰來自核酸中PO-2反對稱伸縮振動，1 080 cm-1吸收峰來自核酸中PO-2對稱伸縮振動[9-10]。死后大鼠脾臟組織這兩個吸收峰明顯下降。DNA和RNA在死后由于核酸酶的作用快速降解，環(huán)境中到處存在RNA酶，故RNA在死后降解速度更快。法醫(yī)學(xué)者通過不同技術(shù)方法來研究核酸死后的降解過程，如單細(xì)胞凝膠電泳、流式細(xì)胞儀、組織化學(xué)結(jié)合圖像分析技術(shù)、PCR等技術(shù)分析死后核酸的降解規(guī)律[2-4]。紅外光譜的方法也可以檢測到核酸降解的變化，且不用對組織進(jìn)行任何的破壞。

3.4 環(huán)境因素影響

隨著環(huán)境溫度升高FTIR光譜變化趨勢增加，大鼠死后三個環(huán)境溫度中FTIR光譜有著不同變化趨勢。環(huán)境溫度4℃，F(xiàn)TIR光譜在觀察吸收峰峰強、峰強比沒有顯著變化，峰強比指標(biāo)不能推斷低溫下尸體死亡時間。低溫下死亡時間推斷，F(xiàn)TIR光譜學(xué)技術(shù)也沒有很好的解決。環(huán)境溫度30℃，大鼠脾臟FTIR光譜峰強比可以看顯著的變化，通過對峰強比定量檢測可以很好的反應(yīng)出變化規(guī)律。FTIR光譜結(jié)果可以有效的反映出20℃、30℃環(huán)境溫度下，脾臟組織死后的光譜學(xué)變化。由于死后較多的因素影響著組織的化學(xué)反應(yīng)，如溫度、濕度、死亡原因等，故FTIR光譜技術(shù)在不同影響因素、不同組織器官的研究將進(jìn)一步深入。由于大鼠和人有較好的生物相似性，本研究為后期人尸體的FTIR光譜檢測提供了良好的動物實驗指導(dǎo)和理論依據(jù)。本實驗結(jié)果表明，F(xiàn)TIR光譜在法醫(yī)死亡時間推斷研究領(lǐng)域有可能成為新的有效方法。

[1]Knight B.Simpson’s Forensic Medicine[M].New York： Oxford University Press，1996：20-28.

[2]陳憶九，王慧君.法醫(yī)病理學(xué)司法鑒定實務(wù)[M].北京：法律出版社，2009：65-94.

[3]Henssge C，Madea B.Estimation of the time since death[J].Forensic Sci Int，2007，165（2）：182-184.

[4]Henssge C，Madea B.Estimation of the time since death in the early post-mortem period[J].Forensic Sci Int，2004，144（2）：167-175.

[5]Dogan A，Ergen K，Budak F，et al.Evaluation of disseminated candidiasis on an experimental animal model：a Fourier transform infrared study[J].Appl Spectrosc，2007，61（2）：199-203.

[6]Wong P T，Wong R K，Caputo T A，et al.Infrared spectroscopy of exfoliated human cervical cells：evidence of extensive structural changes during carcinogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88（24）：10988-10992.

[7]Rigas B，Morgello S，Goldman I S，et al.Human colorectal cancers display abnormal Fourier-transform infrared spectra[J].Proc Natl Acad Sci USA，1990，87（20）：8140-8144.

[8]Cohenford M A，Rigas B.Cytologically normal cells from neoplastic cervical samples display extensive structural abnormalities on IR spectroscopy：implications for tumor biology[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15327-15332.

[9]Schuttlefield J，Al-Hosney H，Zachariah A et al.Grassian，Attenuated total reflection fourier transform infrared spectroscopy to investigate water uptake and phase transitions in atmospherically relevant particles[J].Appl Spectrosc，2007，61（3）：283-292.

[10]Severcan F，Gokduman K，Dogan A，et al.Effects of in-office and at-home bleaching on human enamel and dentin：an in vitro application of Fourier transform infrared study[J].Appl Spectrosc，2008，62（11）：1274-1279.

[11]Severcan F，Gorgulu G，Gorgulu S T，et al.Rapid monitoring of diabetes-induced lipid peroxidation by Fourier transform infrared spectroscopy：evidence from rat liver microsomal membranes[J].Anal Biochem，2005，339（1）：36-40.

[12]Cakmak G，Togan I，Uguz C et al.FT-IR spectroscopic analysis of rainbow trout liver exposed to nonylphenol[J].Appl Spectrosc，2003，57（7）：835-841.

[13]Severcan F，Kaptan N，Turan B.Fourier transform infrared spectroscopic studies of diabetic rat hear crude membranes[J].Spectroscopy，2003，17（2-3），569-577.

[14]Fujioka N，Morimoto Y，Arai T，et al.Discrimination between normal and malignant human gastric tissues by Fourier transform infrared spectroscopy[J].Cancer Detect Prev，2004，28（1）：32-36.

（本文編輯：秦志強）

Forensic Medical Analysis of FTIR Spectral Changes of Rat Spleen Postmortem

HUANG Ping1，2，YU Rong-jun3，LI Li1，4，KE Yong2，F(xiàn)AN Shuang-liang2，WANG Zhen-yuan2
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of justice，Shanghai 200063，China；2.Department of Forensic science，School of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China；3.Ningbo Public Security Bureau，Ningbo 315040，China；4.Department of Forensic Medicine，Shanghai Medical College，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

DF795.3

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2010.05.007

1671-2072-（2010）05-0038-05

2010-04-02

國家自然科學(xué)基金資助項目（30471935）；上海市自然科學(xué)基金資助項目（09ZR1432900）

黃平（1979-），男，博士，助理研究員，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。E-mail：huangpingxjtu@gmail.com。

王振原（1964-），男，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail：wzy218@mail.xjtu.edu.cn。