姜黃素通過下調(diào)miR-186*促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP 凋亡

唐妮 張艱 杜永平

據(jù)報(bào)道，吸煙導(dǎo)致肺癌的發(fā)病率逐漸增多，然而隨著鉑類作為一線抗癌藥物不斷應(yīng)用于臨床，其耐藥已成為目前關(guān)注的熱點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)一種既安全又有效的抗癌藥物并使其應(yīng)用于臨床顯得非常重要。姜黃素是從姜黃科植物的根莖中提取的一種酚性化合物[1,2]，其各種藥理作用已有報(bào)道，包括抗炎、抗氧化及抗腫瘤等[3-5]。

microRNAs（miRNAs）是一組生物體基因組編碼的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，成熟的miRNA長(zhǎng)度為19 nt-25 nt。miRNAs作為最初始的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過RNase III Drosha和Dicer序列加工而被轉(zhuǎn)錄[6]。每個(gè)miRNA可調(diào)控許多mRNA，但是在機(jī)體組織中，miRNA的所有功能均為被系統(tǒng)地闡述[7]，研究[8]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)展中，異常表達(dá)的miRNA起著非常重要的作用。有關(guān)腫瘤發(fā)展過程中基因變化的詳細(xì)知識(shí)或許對(duì)早期臨床診斷和治療措施的構(gòu)建有很大幫助。miR-186*是一個(gè)在人肺腺癌耐藥細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的基因，它在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究旨在闡明姜黃素是否可通過下調(diào)mir-186*的表達(dá)而抑制A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP取自第三軍醫(yī)大學(xué)呼吸病研究所實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液加10%的胎牛血清和100 U/mL青霉素或100 μg/mL鏈霉素于37 °C、 5%CO2的孵箱中孵育。為了保持A549/DDP細(xì)胞耐藥的表型，每次換液時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中均添加順鉑（終濃度為1 μg/mL）。細(xì)胞用胰酶消化后計(jì)數(shù)。

1.2 miRNA芯片檢測(cè) miRNA標(biāo)記及miRNA點(diǎn)陣雜交實(shí)驗(yàn)開始前，將不加順鉑的A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)1周后，消化并記數(shù)。總RNA的提取按照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒說明進(jìn)行。miRNA的進(jìn)一步純化按照Ambion公司的mirVanaTMmiRNA 純化試劑盒進(jìn)行。自A549/DDP細(xì)胞系中提取的RNA用Hy3標(biāo)記。方法：按照Exiqon公司的miRCURYTMArray power標(biāo)記試劑盒進(jìn)行。RNA各自在miRCUPYTMLNA芯片上的雜交按照說明書進(jìn)行（v 8.0, Exiqon）。微點(diǎn)陣圖像的掃描要求用GenePix 4000B掃描，數(shù)據(jù)的分析用GenePix Pro 6.0軟件及Excel表完成。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析從microarray芯片中篩選出的明顯表達(dá)的miRNA RNA的Trizol法提取用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3次，包括減去反轉(zhuǎn)錄的內(nèi)參（U6），以便評(píng)估基因組DNA。用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系的試劑包括：2.0 μL 10×RT緩沖液（Ambion）、2.0 μL dNTPs、2.5 mM each （Ambion）、 1 μL 5×RT引物（如表1所示）、0.3 μL RNase抑制蛋白40 U/μL（Ambion）、2 μL wt-MMLV-RT、100 U/μL（Ambion），最終10 μL的液體里含有500 pg總RNA。實(shí)時(shí)定量PCR中總RNAs的提取與microarray分析中總RNAs來自同種樣品，然后，顯著表達(dá)的miRNAs和內(nèi)參U6用ABI Prism 7600探測(cè)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。樣品置于96孔板中，95 °C 、5 min，95 °C、10 s，60 °C、20 s，72 °C、20 s，分別進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。顯著表達(dá)的miRNA的定量數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct[9]法進(jìn)行分析（表1）。

1.4 miRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染試劑（DharmaFECT1）購買自Dharmacon。 mir-186*mimetics及mimetic controls（均為凍干寡聚核苷酸粉形式）由Dharmacon公司合成。miRNA mimetics是小的單股的miRNA寡聚核苷酸，模仿內(nèi)源性的成熟miRNA。有活性的位點(diǎn)進(jìn)入miRNA的作用途徑調(diào)控目標(biāo)miRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率的簡(jiǎn)單估計(jì)由轉(zhuǎn)染入細(xì)胞Dharamcon公司的雙股siRNA熒光素酶，但未做功能方面的分析。

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞消化后應(yīng)被計(jì)數(shù)，在無抗生素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞。96孔板中，每孔培養(yǎng)液的體積是100 μL，細(xì)胞密度均勻適合，然后放置于37 °C、5% CO2的孵箱中過夜。

1.4.2 轉(zhuǎn)染 將miRNA mimetics和mimetic controls（5 nmol）分別溶解在RNase-free蒸餾水中。在1號(hào)管中溶解2 μM小干擾RNA，在2號(hào)管中加入轉(zhuǎn)染試劑，然后分別在以上兩管中加入無血清的培養(yǎng)液。再將兩管中的溶液上下顛倒混勻后，室溫放置5 min。最后將1號(hào)管中的液體吸出加到2號(hào)管中混勻后，再加入足夠的無抗生素的培養(yǎng)液，室溫放置20 min。之后，將原來的96孔板中的培養(yǎng)液棄掉，再將混合后的溶液以每孔100 μL的體積加到96孔板中。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放置于37 °C、5% CO2的孵箱中孵育48 h。

1.5 凋亡的檢測(cè)

1.5.1 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 凋亡的量用PI和Annexin V-FITC的雙重染色法測(cè)定。PI和Annexin V-FITC試劑盒購自B.D公司。姜黃素處理與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及其各自的對(duì)照組細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，再用5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI室溫孵育30 min，然后細(xì)胞用Becton-Dickinson FACS-420流式細(xì)胞儀分析。其發(fā)射的刺激波長(zhǎng)分別是488 nm和525 nm。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 miR-186*和U6引物序列Tab 1 The primers of miR-186* and U6

1.5.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 15 μmol/L姜黃素處理和用0.02%DMSO作為對(duì)照處理A549/DDP細(xì)胞，24 h后，用預(yù)冷PBS洗滌2次后，分別依次加入MTT溶液20 μL，4 h后，吸取上清液，每孔加入150 mL DMSO，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度。轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics和mimetic controls，48 h后，用預(yù)冷PBS洗滌2次后，分別依次加入MTT溶液20 μL，4 h后，吸取上清液，每孔加入150 mL DMSO，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度。以上實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)4次，存活率（survival rate）=處理組OD/對(duì)照組OD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以MEAN±SD表示，組間比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素處理后miRNAs的表達(dá)水平變化 microarray實(shí)驗(yàn)共獲兩張芯片，每個(gè)miRNAs的結(jié)果在芯片上重復(fù)4次，芯片的結(jié)果全做標(biāo)準(zhǔn)化處理。篩選差異表達(dá)較明顯的miRNAs：15 μmol/L姜黃素處理組與0.02%DMSO對(duì)照組比較后，上調(diào)或下調(diào)30%的miRNAs并且這些miRNAs的表達(dá)量在A549/DDP細(xì)胞中均超過0.2的才被選擇。其中6個(gè)miRNAs的表達(dá)顯著下調(diào)，6個(gè)miRNAs的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。在這些miRNAs中，mir-30b顯著上調(diào)56.5%，miR-186*顯著下調(diào)45.2%（圖1）。

圖1 與DMSO對(duì)照組相比，姜黃素處理后差異表達(dá)明顯的miRNAsFig 1 The significantly differentially expressed miRNAs after Curcumin treatment compared to DMSO controls

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證miR-186*的表達(dá) microarray分析結(jié)果：與DMSO對(duì)照組相比，姜黃素處理后，miR-186*表達(dá)下調(diào)45.2%（n=3, P＜0.05）。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果：姜黃素處理后，miR-186*的表達(dá)量為0.7±0.1，未處理組miR-186*的表達(dá)量為1.4±0.2。與DMSO對(duì)照組相比，姜黃素處理后，miR-186*的表達(dá)下調(diào)70.0%（n=3, P＜0.05）。實(shí)時(shí)定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了microarray分析結(jié)果（圖2）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)由miR-186*調(diào)控的細(xì)胞凋亡 15 μmol/L姜黃素處理和用0.02%DMSO作為對(duì)照處理A549/DDP細(xì)胞，孵育24 h后收集細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics和mimetic controls，孵育48 h后收集細(xì)胞。流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡圖（圖3A、圖3B）。圖3a表示姜黃素處理后與DMSO作為對(duì)照處理后細(xì)胞凋亡率。姜黃素處理后，細(xì)胞凋亡率為（8.6±0.9）%；DMSO作為對(duì)照處理后，細(xì)胞凋亡率為（3.0±0.4）%。與對(duì)照組相比，姜黃素處理后，細(xì)胞的凋亡率增加5.6%，姜黃素處理組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3, P＜0.05）；圖3b表示轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics和mimetic controls后細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics后，細(xì)胞凋亡率為（1.5±0.4）%，轉(zhuǎn)染miR-186*mimetic controls后，細(xì)胞凋亡率為（3.1±1.0）%。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics后，細(xì)胞凋亡率減少1.6%，miR-186*mimetics與mimetic controls比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3, P＜0.05）。細(xì)胞凋亡率=Q2或Q2-1象限早期凋亡細(xì)胞的比率。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-186*表達(dá)Fig 2 The profile of miR-186* assayed by quantitative real-time PCR

圖3 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)由miR-186*調(diào)控的細(xì)胞凋亡A： 姜黃素組、DMSO組的細(xì)胞凋亡圖；a： 姜黃素組、DMSO組的細(xì)胞凋亡。B：mimetics組、mimetic controls組的細(xì)胞凋亡圖；b： mimetics組、mimetic controls組的細(xì)胞凋亡。Fig 3 The apoptosis of miR-186* modulating detected by flow cytometry methodA: The cell apoptosis graph of curcumin group and DMSO group; a: The cell apoptosis rate of curcumin group and DMSO group.B: The cell apoptosis graph of mimetics group and mimetic controls group; b: The cell apoptosis rate of mimetics group and mimetic controls group.

圖4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率A：姜黃素組、對(duì)照組的細(xì)胞存活率；B：mimetics組、mimetics controls組的細(xì)胞存活率。Fig 4 The survival rates measured by MTT methodA: The cell survival rate of curcumin group and the control group; B: The cell survival rate of mimetics group and mimetics controls group.

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 15 μmol/L姜黃素處理和用0.02%DMSO作為對(duì)照處理A549/DDP細(xì)胞，24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：以未處理細(xì)胞存活率為100%作參照，標(biāo)準(zhǔn)化后，得出姜黃素處理后，細(xì)胞存活率為（55.6±5.1）%。與對(duì)照組相比，姜黃素處理后，細(xì)胞存活率下降了44.4%，姜黃素處理組與其對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=4, P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics和mimetic controls，48 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：以轉(zhuǎn)染miR-186*mimetic controls后細(xì)胞存活率為100%作參照，標(biāo)準(zhǔn)化后，得出轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics后，細(xì)胞存活率為（149.0±7.0）%。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics后，細(xì)胞存活率增加了49.0%，miR-186*mimetics與mimetic controls比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=4, P＜0.05）（圖4A、圖4B）。

3 討論

姜黃素是從姜黃、郁金、菖蒲等中藥的根莖中提取的一種酚性化合物，具有降壓、抗心肌缺血、抗凝、降脂等多種作用，已有文獻(xiàn)[10]報(bào)道姜黃素對(duì)人胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞等均具有明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。耐順鉑人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞株是由親本人肺腺癌A549細(xì)胞株經(jīng)DDP長(zhǎng)期誘導(dǎo)形成的，已有文獻(xiàn)[11]報(bào)道姜黃素對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖有抑制作用。

目前體內(nèi)外的研究清楚地表明異常表達(dá)的miRNA與癌癥的發(fā)生有很大相關(guān)性。miRNA基因的表達(dá)僅占人類細(xì)胞有表達(dá)的所有基因的1%，但它被預(yù)測(cè)為可調(diào)控60%人類蛋白編碼基因的表達(dá)[12,13]，這就表明miRNA參與幾乎所有基因通路的重要作用[14]。除此以外，大量證據(jù)表明：人類癌癥的發(fā)生與miRNA的突變和異常表達(dá)密切相關(guān)，miRNA對(duì)人類癌癥的病理學(xué)和生理學(xué)的研究起著舉足輕重的作用[15]。掌握了這些知識(shí)，miRNA在腫瘤耐藥細(xì)胞表達(dá)量的變化，將為臨床對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后提供依據(jù)。換句話說，當(dāng)研究聚焦在正常組織中miRNA與腫瘤耐藥細(xì)胞中miRNA表達(dá)量比較時(shí)，在估計(jì)臨床診斷和預(yù)后方面，更重要的是將miRNA的表達(dá)與腫瘤耐藥細(xì)胞的表型或臨床參數(shù)聯(lián)系起來，從而為臨床提供診斷和預(yù)后依據(jù)。

在腫瘤細(xì)胞中一些異常表達(dá)的miRNA可被清楚的分為致癌和抑癌基因。已有文獻(xiàn)報(bào)道姜黃素通過調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中的miRNAs的表達(dá)，從而產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。胰腺癌中miR-23a、miR-22、miR-21的表達(dá)比正常組織降低，姜黃素可以上調(diào)它們的表達(dá)[19]；反之，miR-7、miR-199a*、miR-92在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)被上調(diào)，姜黃素可以下調(diào)它們的表達(dá)[19]，其參與的信號(hào)通路例如：姜黃素通過上調(diào)miR-22的表達(dá)并下調(diào)其下游靶基因ESR1的表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖[19]。以上說明姜黃素可能通過調(diào)控miRNAs的表達(dá)而促使腫瘤細(xì)胞凋亡。而且，大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明了姜黃素在腫瘤相關(guān)信號(hào)分子方面的可能的多種藥理作用的復(fù)雜機(jī)理[16-19]。但姜黃素通過調(diào)控miR-186*的表達(dá)而誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞的凋亡的研究尚未見報(bào)道。

miR-186*是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的分子，位于染色體1p31.1，我們通過microarray分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在姜黃素處理的A549/DDP細(xì)胞中被明顯下調(diào)，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了microarray分析結(jié)果。流式細(xì)胞儀法分別檢測(cè)姜黃素處理后與DMSO作為對(duì)照處理后，A549/DDP細(xì)胞凋亡情況：與對(duì)照組相比，姜黃素處理后，細(xì)胞的凋亡增加5.6%；轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics與mimetic controls后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的凋亡減少1.6%。MTT法檢測(cè)姜黃素處理后與DMSO作為對(duì)照處理后，細(xì)胞存活率情況：與對(duì)照組相比，姜黃素處理后，細(xì)胞存活率下降了44.4%；轉(zhuǎn)染miR-186*mimetics與mimetic controls后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率增加了49.0%。由此我們的得出姜黃素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)理如下：姜黃素通過下調(diào)miR-186*的表達(dá)而抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖。

綜上，姜黃素抑制A549/DDP細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡可能是通過調(diào)控miR-186*而發(fā)揮作用的，然而所參與的信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。