實時熒光定量PCR 檢測人肺腺癌細胞Anip973、Anip973/NVB中hTERT mRNA的 表達

陳公琰 郭淑英 柳菁菁

肺癌是全世界常見的惡性腫瘤，是人類惡性腫瘤死亡的主要原因。由于三分之二的肺癌病人就診時已屬晚期，失去了手術(shù)機會，而化療是中晚期肺癌治療最重要的有效手段。然而化療過程中腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥是化療失敗的主要原因之一，也是治療腫瘤的主要難題，如何克服腫瘤細胞多藥耐藥是目前臨床治療所面臨的巨大挑戰(zhàn)。端粒酶是一種細胞核糖核蛋白酶，端粒酶RNA片斷可作為模板將端粒DNA合成到染色體末端[1]。端粒酶與腫瘤細胞的增殖和永生化密切相關(guān)，端粒酶的激活可以使端粒長度不斷延長，從而使細胞無限增殖形成腫瘤。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）為端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活化的關(guān)鍵成分，與端粒酶活性密切相關(guān)。相關(guān)研究[2,3]表明端粒酶活性與細胞對化療藥物的敏感性密切相關(guān)，端粒酶活性高的病人化療效果差，說明端粒酶有可能參與了多藥耐藥機制。本研究采用實時熒光定量RT-PCR法檢測經(jīng)長春瑞濱（Navelbine, NVB）處理前后人肺腺癌耐藥細胞Anip973/NVB與親代細胞Anip973的hTERT mRNA表達水平，探討端粒酶是否參與腫瘤的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株Anip973由黑龍江省腫瘤研究所惠贈，人肺腺癌耐藥細胞株Anip973/NVB由作者前期誘導(dǎo)建立[4]，NVB終濃度為2.0 μg/mL。細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37oC、5%CO2的飽和濕度孵箱培養(yǎng)。每2天-3天傳代一次，每日觀察細胞形態(tài)，取對數(shù)生長細胞用于實驗。Anip973細胞和Anip973/NVB細胞均加入濃度為2.0 μg/mL的NVB，培養(yǎng)48 h后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 NVB購自法國皮爾·法伯藥物研制公司；二甲基四氮唑藍（MTT）購自Sigma；順鉑（CDDP）購自科鼎醫(yī)療有限公司；表阿霉素（EPI）購自浙江海工藥業(yè)股份有限公司；健擇（GEM）購自禮來公司；伊立替康（CPT-11）購自輝瑞公司；足葉乙甙（VP-16）麗珠集團利民制藥廠；RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒購自廣州達暉生物技術(shù)有限公司；引物、Taqman探針由廣州達暉生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 MTT法測定細胞抗藥性 取對數(shù)生長期的Anip973細胞和Anip973/NVB細胞，以1×104/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL，37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，分組加藥，每個濃度設(shè)3個平行孔，處理組加入培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的各種化療藥物（長春瑞濱、順鉑、表阿霉素、健擇、依立替康、足葉乙甙）各20 μL，陰性對照組加生理鹽水，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，甩板去除培養(yǎng)液后每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩至沉淀完全溶解，在全自動酶標儀上選擇波長490 nm測定吸光值（A值），根據(jù)A值計算各藥物的半數(shù)抑制率（IC50）。根據(jù)各組細胞IC50與敏感細胞IC50的比值計算耐藥指數(shù)（resistance index, RI）。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 引物與探針 引物、Taqman探針由廣州達暉生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

1.5 細胞總RNA提取 采用UNIQ-10柱總RNA提取試劑盒提取RNA，實驗步驟按說明書進行。使用紫外分光光度儀來檢測提取總RNA的含量及純度。要求A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高，未被蛋白質(zhì)、酚污染，完全可以滿足RT-PCR需要。

1.6 cDNA的合成 反應(yīng)體系20 μL。包括5×逆轉(zhuǎn)錄buffer [50 mmol Tris-HCl（pH8.0）, 50 mmol KCl, 4 mmol MgCl2, 10 mmol DTT] 4 μL，上游外引物（10 pmol/μL）0.4 μL，下游外引物（10 pmol/μL）0.4μL，dNTPs（10 mmol/μL）0.2 μL，MMLV（200 U/μL）1 μL，DEPC水9 μL，RNA模板5 μL。反應(yīng)條件為37oC、60 min，95oC、3 min。

1.7 熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系50 μL。包括5×PCR buffer[10 mmol Tris-HCl（pH8.0）, KCl 50 mmol, MgCl22 mmol]10 μL，上游內(nèi)引物F（10 pmol/μL）1 μL，下游內(nèi)引物R（10 pmol/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol）1 μL，cDNA產(chǎn)物5 μL，ddH2O 32 μL。反應(yīng)條件為93oC、2 min，93oC、45 s，55oC、1 min，共40個循環(huán)。

1.8 標準曲線的繪制 標準品質(zhì)粒的構(gòu)建由廣州達暉生物技術(shù)有限公司完成，作為制備標準曲線的模板，與待測樣品同時進行PCR擴增，繪制標準曲線。用2-ΔΔCt法計算各個樣品的hTERT表達量，其中ΔCt =檢測樣品Ct值-內(nèi)參Ct值；ΔΔCt=陽性待測組樣品ΔCt-正常樣品組ΔCt。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩兩比較用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 耐藥譜分析 MTT法檢測耐藥細胞與親代細胞對各種抗癌藥的細胞毒作用，結(jié)果表明Anip973/NVB對NVB的耐藥指數(shù)為27.43，并對伊立替康、順鉑、足葉乙甙、表阿霉素等未接觸過的抗腫瘤機制不同的抗癌藥物也產(chǎn)生交叉耐藥（P＜0.05），見表2，表明其耐藥性穩(wěn)定。

2.2 總RNA的OD值及濃度 RNA樣品A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高，未被蛋白質(zhì)、酚污染，完全可以滿足RT-PCR需要。RNA的濃度：Anip973細胞為1.008 μg/μL，Anip973/NVB細胞為0.912 μg/μL。

圖1 不同模板濃度下hTERT實時PCR熒光曲線Fig 1 Real-time flourescence curves of hTERT in different template quantity From left to right the concentrations of templates are: 1×105, 1×106, 1×107, 1×108.

圖2 hTERT的實時PCR標準曲線Fig 2 Standard real-time PCR curve of hTERT

圖3 Anip973/NVB和Anip973細胞hTERT的實時PCR熒光曲線Fig 3 Real-time PCR flourescence curves of Anip973/NVB and Anip973 1, 2, 3: Anip973 cell; 4, 5, 6: Anip973/NVB cell.

2.3 hTERT mRNA標準品熒光曲線與標準曲線 圖1為梯度稀釋的hTERT mRNA標準品的動態(tài)擴增曲線，根據(jù)動態(tài)擴增曲線建立標準曲線，以模板稀釋倍數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，循環(huán)閾值（cyle threshold, Ct）值為縱坐標，表明在1×105-1×108范圍內(nèi)以10倍梯度稀釋這樣一個大的跨度范圍內(nèi)，DNA的拷貝數(shù)與Ct之間存在良好的線性關(guān)系，統(tǒng)計學(xué)分析相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，線性關(guān)系極好。圖2顯示不同起始濃度模板進入PCR指數(shù)增長期的起始點即不同，拷貝數(shù)越大Ct值越小。不同濃度的模板進入PCR平臺期后，PCR產(chǎn)物差異也比較大且不成比例。不同濃度標準品的Ct值與該標準品濃度的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始濃度越高，Ct值就越小。

表1 引物和Taqman探針序列Tab 1 The sequences of primers and Taqman probes

表2 Anip973和Anip973/NVB細胞藥物敏感性對比Tab 2 The contrast of drug sensitivity between Anip973 and Anip973/NVB cell

表3 Anip973和Anip973/NVB細胞hTERT mRNA的表達Tab 3 Expression of hTERT mRNA in Anip973 and Anip973/NVB cell

2.4 NVB對Anip973和Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達的影響 2.0 μg/mL NVB處理前后親代細胞與耐藥細胞的hTERT mRNA表達見表2，反應(yīng)后的熒光曲線見圖3。對照組Anip973和Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；NVB處理組Anip973細胞hTERT mRNA表達顯著降低，與對照組Anip973細胞比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；NVB處理組Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達亦有降低，但與對照組Anip973/NVB細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在NVB處理組，Anip973細胞hTERT mRNA表達的降低程度明顯高于Anip973/NVB細胞 （P＜0.01），有統(tǒng)計學(xué)差異（表3）。

3 討論

腫瘤細胞的多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一。端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，hTERT是端粒酶活性調(diào)控的限速因子，hTERT基因的表達與端粒酶活性表達一致。在腫瘤發(fā)生過程中，端粒酶的再激活可能參與細胞癌變過程。有研究[2,5]表明抑制端粒酶活性可提高細胞對化療藥物的敏感性，化療藥物也可降低腫瘤細胞的端粒酶活性，hTERT mRNA可能與MDR1、MRP-mRNA及C-myc相關(guān)[6]，提示端粒酶可能參與了腫瘤細胞的耐藥機制。

本實驗以人肺腺癌Anip973、Anip973/NVB細胞為研究對象。Anip973/NVB細胞是通過逐漸增加劑量法誘導(dǎo)而成，是穩(wěn)定的肺癌獲得性多藥耐藥細胞系[4]，用MTT法進行耐藥譜分析，Anip973、Anip973/NVB細胞48 h的IC50值分別為0.38 μg/mL、10.38 μg/mL，RI為27.43，對伊立替康等四種藥物也產(chǎn)生了交叉耐藥，說明其耐藥性穩(wěn)定。用實時熒光定量RT-PCR法檢測了Anip973、Anip973/NVB細胞hTERT mRNA的表達情況，在模板稀釋1 000倍時，hTERT標準品表現(xiàn)為陽性擴增，呈明顯的S型，其靈敏度達到了極限，可以檢測到微量的基因，這是傳統(tǒng)的PCR難以做到的，說明實時PCR技術(shù)有較高的靈敏度。本研究結(jié)果表明Anip973、Anip973/NVB細胞均有端粒酶hTERT mRNA表達，對照組親代細胞和耐藥細胞的hTERT mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），NVB處理組Anip973細胞hTERT mRNA表達明顯降低（P＜0.01），而Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達雖有下調(diào)趨勢，但與對照組耐藥細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），同時NVB處理組Anip973/NVB細胞hTERT mRNA表達明顯高于Anip973細胞（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明在化療藥物長期刺激下，端粒酶的表達活性更加穩(wěn)定且能保持持續(xù)活化，細胞自身修復(fù)能力明顯增強，使得耐藥細胞對化療藥物具有更加良好的抵抗性和適應(yīng)性。由此可見，端粒酶與腫瘤細胞多藥耐藥具有一定的相關(guān)性，這與相關(guān)文獻報道相似[7,8]。

端粒酶在維持長度、保持染色體穩(wěn)定性方面有重要作用，在絕大多數(shù)腫瘤細胞中都有端粒酶高表達，正常細胞中端粒酶不表達或低表達。在正常組織和腫瘤組織中端粒酶表達、端粒長度和細胞動力學(xué)的差別顯示出以端粒酶作為治療靶點會相對安全，抑制端粒酶能有效提高耐藥細胞對化療藥物的敏感性[9]，針對端粒酶的反義治療有利于逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[10,11]，提示端粒酶抑制劑可治療腫瘤并有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥。本實驗利用實時熒光定量RT-PCR法檢測hTERT mRNA表達，證實端粒酶可能參與了人肺腺癌Anip973/NVB細胞的MDR，提示可將端粒酶作為逆轉(zhuǎn)耐藥的新靶點，至于如何利用端粒酶抑制劑逆轉(zhuǎn)耐藥及如何將其應(yīng)用于臨床仍需在今后的研究中進一步探索。