SD大鼠與Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型的建立及比較

王曉武，李康樗，丁桂榮，徐勝龍，周詠春，譚 娟，常英娟，郭國禎

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系放射醫(yī)學(xué)教研室，西安 710032; 2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院放射科，西安 710031)

研究報(bào)告

SD大鼠與Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型的建立及比較

王曉武1，李康樗1，丁桂榮1，徐勝龍1，周詠春1，譚 娟1，常英娟2，郭國禎1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系放射醫(yī)學(xué)教研室，西安 710032; 2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院放射科，西安 710031)

目的 比較利用SD大鼠、Wistar大鼠建立腦膠質(zhì)瘤動物模型的不同，為研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供操作平臺。方法利用立體定向儀建立 SD大鼠、Wistar大鼠大腦皮層接種C6細(xì)胞(2.5×105個細(xì)胞/只)，建立腦膠質(zhì)瘤動物模型，利用組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)以及核磁共振成像等技術(shù)，比較兩種動物模型在成瘤率、腫瘤生長狀況、死亡率以及動物一般情況等方面的異同。結(jié)果SD大鼠組、Wistar大鼠組的成瘤率均為100%，兩組均未見轉(zhuǎn)移;但SD大鼠組腫瘤成瘤時(shí)間較長，且部分腫瘤有自愈傾向，而Wistar大鼠組則未出現(xiàn)類似情況。結(jié)論Wistar大鼠大腦皮層腦膠質(zhì)瘤動物模型的腫瘤性狀更接近于人的腦膠質(zhì)瘤，因此更適合探索和研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和治療方法;而SD大鼠的腫瘤由于性狀類似轉(zhuǎn)移瘤，且有自愈傾向，不適合作為上述相關(guān)研究的動物模型。

腦膠質(zhì)瘤;模型，動物;SD大鼠;Wistar大鼠

腦膠質(zhì)瘤是一種常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差，臨床平均生存期少于一年。目前，各種治療效果不佳，因此有必要建立合適的膠質(zhì)瘤動物模型以便進(jìn)一步研究腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制及治療方案。本文將大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種在SD大鼠、Wistar大鼠大腦皮層，建立兩種腦膠質(zhì)瘤動物模型，通過采用病理學(xué)及影像學(xué)觀察，比較兩種動物模型的差異，為提供合適的腦膠質(zhì)瘤動物模型提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 人腦膠質(zhì)瘤C6和實(shí)驗(yàn)動物:C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源于第四軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室。實(shí)驗(yàn)動物:Wistar大鼠，雄性，體重150～160 g，共20只，大腦皮層接種 C6細(xì)胞。SD大鼠，雄性，體重210～220 g，共20只，大腦皮層接種 C6細(xì)胞。SD大鼠、Wistar大鼠均購于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［SCXK(軍)2007-007，SYXK(軍)2007-020］。

1.1.2 儀器和試劑:儀器主要包括CO2孵箱(日本理化工業(yè)株式會社)，超凈工作臺(天津市特斯泰儀器有限公司)，臺式離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀有限公司)，腦立體定向儀(西安西北光電儀器廠)，牙科臺式電鉆車(上海齒科醫(yī)械廠)，25 μL微量注射器(上海濟(jì)成分析儀器有限公司)，簡易手術(shù)包，顯微鏡(Nikon)，核磁共振儀(西門子公司);試劑主要包括新生牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，兔抗鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)多克隆抗體(博奧森公司)，SABC(中杉公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物準(zhǔn)備:動物于接種細(xì)胞前開始進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動物體重增加35±3 g。

1.2.2 C6細(xì)胞準(zhǔn)備:C6復(fù)蘇后，在接種前至少傳代一次，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時(shí)(2/3培養(yǎng)瓶底長滿)收集細(xì)胞(于收集細(xì)胞前24 h更換培養(yǎng)液)。收集細(xì)胞時(shí)，先用0.01 mol/L PBS洗滌一次，再用0.25%胰酶消化，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞收縮變圓，且有個別細(xì)胞脫落時(shí)加入少量含10%血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，棄去液體后，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，800 r/min離心4 min，采用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，制備2.5×107/mL細(xì)胞懸液，置于37℃ CO2孵箱中待用。

1.2.3 動物麻醉及準(zhǔn)備:大鼠經(jīng) 10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)經(jīng)腹腔麻醉后，固定于西安西光儀器廠生產(chǎn)大鼠腦立體定向儀。動物頭部固定于立體定向架，兩耳錘深入外耳道對稱固定，剪去頭頂部毛發(fā)約1.0 cm×1.0 cm，碘酒、75%乙醇消毒皮膚后鋪孔巾，無影燈聚焦于種植部位。

1.2.4 顱骨鉆孔及顱內(nèi)C6細(xì)胞接種:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1－3］，確定接種靶點(diǎn)，在內(nèi)眥連線與頭部矢狀中線交匯處縱向切口1.0 cm，分離皮膚暴露顱骨，在前囟位置，向右旁開3.0 mm，冠狀縫前0.5 mm坐標(biāo)定位鉆孔至硬膜，孔徑1.0 mm。25 μL微量注射器吸入吹打混勻的細(xì)胞懸液(密度為2.5×107/mL，2.5×105個細(xì)胞/只，體積為10 μL)，硬膜下進(jìn)針3 mm，退1 mm，顱內(nèi)注射速度為2 μL/min，注射完畢留針 5 min，緩慢拔針。骨孔用骨蠟封閉，術(shù)野用0.9%NaCl沖洗后縫合切口。術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

1.3.1 接種后動物處理及一般情況觀察:大鼠接種后置籠自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)7 d皮下注射青霉素;每天觀察動物的進(jìn)食、飲水、運(yùn)動及精神等狀態(tài);記錄死亡時(shí)間;每2天稱重1次。

1.3.2 大鼠腦MRI檢查:在接種后2周和3周實(shí)驗(yàn)動物做核磁共振成像(MRI)檢查，活體觀察腫瘤的生長情況。用Magnetom Ttio Tim(德國)超導(dǎo)3.0 Tesla成像系統(tǒng)(陜西西安西京醫(yī)院核磁室)，冠狀、矢狀及橫斷面T1加權(quán)(TR:4500 ms，TE:87 ms)掃描，層厚2 mm，Image matix:259×384。T2W1加權(quán)掃描。測量不同瘤齡腫瘤的最大左右徑和上下徑，計(jì)算不同瘤齡的腫瘤體積。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查:大鼠用10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)左心室快速灌注 0.9%NaCl，再灌注 4℃4% 多聚甲醛。取出全腦后，按大鼠腦表面的接種穿刺點(diǎn)為中心做冠狀切口，觀察腫瘤生長情況。并全面檢查有無肺、肝臟及腦內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤組織取出后置于4% 多聚甲醛在4℃后固定3～4 d。組織標(biāo)本經(jīng)脫水、包埋后取3 μm切片，HE染色。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查:腫瘤石蠟切片經(jīng)脫蠟后進(jìn)行膠質(zhì)酸性纖維蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫組織化學(xué)染色。一抗為兔抗大鼠GFAP (1∶150)，二抗為羊抗兔(即用型)。觀察GFAP在C6腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以確定C6膠質(zhì)細(xì)胞源性腫瘤的特性。

2 結(jié)果(圖2～7見彩插1)

2.1 一般情況觀察

成瘤率:SD大鼠和Wistar大鼠腦內(nèi)接種C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成功率均為100%(20/20)。兩組動物于接種細(xì)胞后，第3天自行進(jìn)食，飲水、飲食較接種細(xì)胞前減少，體重下降，反應(yīng)遲鈍。SD大鼠組于接種細(xì)胞后約1周情況好轉(zhuǎn)，體重趨于平穩(wěn)，并于細(xì)胞接種約2周時(shí)體重出現(xiàn)增加趨勢;而Wistar大鼠組體重恢復(fù)較慢，在接種后2周時(shí)大多出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，有的表現(xiàn)為狂躁，有的出現(xiàn)向上觀望的癥狀。體重結(jié)果見圖1。

圖1 SD大鼠和Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型建立后體重變化Fig.1 Changes of body weight after establishment of SD rats and Wistar rats of cerebral glioma model

死亡率:觀察腦內(nèi)接種 C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞至30 d，SD大鼠組未出現(xiàn)死亡，Wistar大鼠組有2只死亡(分別于接種細(xì)胞第16天、第19天死亡)，死亡率為10%。

2.2 大體標(biāo)本及HE染色

SD大鼠組、Wistar大鼠組大體標(biāo)本觀察，C6細(xì)胞以接種點(diǎn)為中心，在大腦皮層處呈團(tuán)塊狀生長，腫瘤形狀呈不規(guī)則形或橢圓形。SD大鼠組有包膜，邊界較清楚;Wistar大鼠組無包膜，腫瘤組織向周圍腦組織浸潤性生長。兩組均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤。

HE染色結(jié)果顯示，兩個品系的接種大鼠腫瘤細(xì)胞均生長活躍，異型性明顯，可見病理性分裂相。SD大鼠組腫瘤組織與正常組織之間雖然可見到腫瘤細(xì)胞浸潤，但可以看到一個較明顯的邊界，在瘤組織內(nèi)可見壞死區(qū)及液化空腔(圖2)，Wistar大鼠組組腫瘤組織與正常組織之間可見到明顯的腫瘤細(xì)胞浸潤，邊界不清，瘤組織內(nèi)可見腫瘤血管和血竇形成(圖3)。

2.3 GFAP免疫組織化學(xué)、Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模

SD大鼠、Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的瘤組織內(nèi)均可見散在的GFAP陽性細(xì)胞(圖4，圖5)。表明腫瘤為膠質(zhì)細(xì)胞來源。

2.4 核磁共振影像學(xué)檢查

核磁共振觀察證實(shí)，SD大鼠、Wistar大鼠腦內(nèi)接種C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成功率為100%。且SD大鼠、Wistar大鼠均未見轉(zhuǎn)移(圖6，圖7)。SD大鼠組的個別動物的腫瘤出現(xiàn)體積顯著減小，有自愈傾向。Wistar大鼠的腫瘤未出現(xiàn)體積減小的現(xiàn)象。

3 討論

建立可靠的動物模型是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，大鼠C6腦膠質(zhì)瘤同種移植瘤動物模型是腦膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最為廣泛的模型之一［4］。C6細(xì)胞是經(jīng)過N-亞硝基甲脲(N-nitosomethylurea)誘發(fā)的Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。該細(xì)胞經(jīng)體外和體內(nèi)傳代培養(yǎng)，生長穩(wěn)定并具有 GFAP和 S-100蛋白等膠質(zhì)瘤特異性標(biāo)志。大鼠腦內(nèi)接種后腫瘤形成較快，種植腫瘤成活率較高，大鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長特點(diǎn)與人較為接近，所以廣泛應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究［5］。本實(shí)驗(yàn)中利用C6腦膠質(zhì)瘤建立的SD大鼠、Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型的成功率均為100%。有研究報(bào)道 C6腦膠質(zhì)瘤動物模型接種懸液的細(xì)胞數(shù)量影響模型的成功率［6］。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞接種方面主要由以下幾個方面的改進(jìn):1)接種細(xì)胞數(shù):本實(shí)驗(yàn)接種 C6細(xì)胞的密度為2.5×107/mL，細(xì)胞總量控制在(2.5～3)×105個細(xì)胞/只之間，接種細(xì)胞懸液體積控制在10 μL，與國內(nèi)外報(bào)道接種細(xì)胞數(shù)量在 105～107之間的一致［7，8］。2)消化細(xì)胞:為盡量避免細(xì)胞受損，在細(xì)胞處理方面本實(shí)驗(yàn)也稍有改進(jìn)。將細(xì)胞消化后用Hanks液洗滌2次，再以Hanks液制成細(xì)胞懸液，改為將細(xì)胞消化后，先用含10%血清的 DMEM液終止消化，再用不含血清DMEM液洗滌，最后以DMEM液制成細(xì)胞懸液，離心時(shí)間也由8 min縮短至4 min，從而盡量減少洗滌細(xì)胞、離心等處理細(xì)胞的時(shí)間，使細(xì)胞處于良好的狀態(tài)，保證接種成功率。接種前充分混勻細(xì)胞懸液，避免堆積，保證均勻的單細(xì)胞懸液。3)進(jìn)針深度:硬膜下進(jìn)針3 mm，退1 mm。這樣在靶點(diǎn)處留一空隙，既防止細(xì)胞溢出，使細(xì)胞充分沉積，又延長了腫瘤細(xì)胞與靶組織的接觸時(shí)間，從而提高成瘤率。4)建立大批量動物模型時(shí)C6細(xì)胞的代次與模型一致性的關(guān)系:本課題組在長期、大量建立大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型實(shí)驗(yàn)中，首先保證每次接種的所有細(xì)胞均為同一凍存批次;其次，細(xì)胞復(fù)蘇后均傳代2次，第二次傳代時(shí)，接種細(xì)胞數(shù)要有一定的梯度，從而保證連續(xù)2～3 d接種時(shí)均能有滿足要求的細(xì)胞;細(xì)胞接種前24 h換培養(yǎng)液;接種細(xì)胞時(shí)，各個環(huán)節(jié)要配合好，盡量縮短動物麻醉、接種部位定位的時(shí)間，每消化一次細(xì)胞接種2～3只動物;另外，處理細(xì)胞條件保持一致，包括培養(yǎng)液、血清、緩沖液、消化液，以及洗滌細(xì)胞時(shí)間、離心時(shí)間等。滿足以上要求，我們就能建立均勻一致的腦膠質(zhì)瘤動物模型。我們根據(jù)上述方法建立的腦膠質(zhì)瘤動物模型腫瘤成瘤率高，SD大鼠組、Wistar大鼠組成瘤率均為100%;腫瘤細(xì)胞生長穩(wěn)定，腫瘤細(xì)胞具有分化程度低，微血管豐富，生長迅速，與人膠質(zhì)瘤的生長特性相似，可作為基礎(chǔ)、臨床腦膠質(zhì)瘤病因?qū)W、藥效學(xué)研究的動物模型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SD大鼠組、Wistar大鼠組在腦膠質(zhì)瘤腫瘤組織內(nèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP反應(yīng)呈弱陽性，周圍膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈強(qiáng)陽性，且細(xì)胞數(shù)明顯多于遠(yuǎn)離腫瘤的組織，與相關(guān)報(bào)道相一致［9］。GFAP與膠質(zhì)細(xì)胞的分化程度有關(guān)，由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化比較幼稚，所以腫瘤內(nèi)細(xì)胞GFAP呈弱陽性，腫瘤周圍膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多且呈強(qiáng)陽性，可能與膠質(zhì)瘤刺激周圍腦組織引起的膠質(zhì)細(xì)胞增生有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SD大鼠組有包膜，邊界清楚，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］。SD大鼠組的個別動物的腫瘤出現(xiàn)體積減小，接種細(xì)胞2周后體重呈上升趨勢，提示SD大鼠的C6膠質(zhì)瘤可能因自身免疫活性較高而有自愈傾向［11］，出現(xiàn)自然消亡。此結(jié)果表明，SD大鼠的腦膠質(zhì)瘤動物模型不適合用于腦膠質(zhì)瘤的病因?qū)W、藥效學(xué)、血腦屏障等相關(guān)研究;而Wistar大鼠腫瘤細(xì)胞浸潤明顯，與周圍正常腦組織邊界不清，腫瘤體積呈進(jìn)行性增長，這些特性與人惡行腦膠質(zhì)瘤類似，因此在做此類相關(guān)研究時(shí)應(yīng)選用Wistar大鼠制備腦膠質(zhì)瘤動物模型。

［1］ 郭敏，關(guān)麗明，戚喜勛.大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型建立及X刀治療的護(hù)理［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(2):123－124.

［2］ Samuel V，Emmanuel L，Barbier，et al.In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma［J］.Neuroimage，2008，40(2):973－983.

［3］ Doblas S，Saunders D， KshirsagarP， etal. Phenyl-tertbutylnitrone induces tumor regression and decreases angiogenesis in a C6 rat glioma model［J］.Free Radic Biol Med，2008，44 (1):63－72.

［4］ 王煜，牛洪泉，董芳永，等.大鼠樹突狀細(xì)胞疫苗治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國神經(jīng)外科疾病雜志，2005，10:115－117.

［5］ 林健，王偉民，徐如祥.C6大鼠膠質(zhì)瘤模型及其在腦膠質(zhì)瘤治療研究中應(yīng)用的缺陷［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2003;2(2): 154－156.

［6］ 高大寬，章翔，吳景文，等.建立大鼠 C6腦膠質(zhì)瘤模型的有效方法［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2000，17(1):93.

［7］ 李維方，張光霖，朱誠，等.VEGF反義寡核苷酸抑制荷瘤大鼠膠質(zhì)瘤血管生成的作用和效果［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2003，28(2):144－145.

［8］ Watanabe K，Sakamoto M，Somiya M，et al.Feasibility and limitation of the rat model by C6 gliomas implanted at the subcutaneous region［J］.Neurol Res，2002，24(5):485－490.

［9］ Sasaki T，YamazakiK， YamoriT， etal. Inhibition of proliferation and induction of differentiation of glioma cells with Datura stramonium agglutinin［J］.Br J Cancer，2002，87(8): 918－923.

［10］ Farrell CL，Stewart PA，Del Maestro RF.A new glioma model in rat:the C6 spheroid implantation technique permeability and vascular characterization［J］.J Neurooncol，1987，4(4):403－415.

［11］ Vince GH，Bendszus M，Schweitzer T，et al.Spontaneous regression of experimental gliomas:an immunohistochemical and MRI study of the C6 glioma spheroid implantation model［J］. Exp Neurol，2004，190(2):478－485.

Establishment and Comparison of Sprague-Dawley Rats and Wistar Rats of Cerebral Glioma Model

WANG Xiao-wu1，LI Kang-chu1，DING Gui-rong1，XU Sheng-long1，ZHOU Yong-chun1，TAN Juan1，CHANG Ying-juan2，GUO Guo-zhen1
(1.Department of Radiation Medicine，F(xiàn)aculty of Preventive Medicine，Xi'an 710032，China; 2.Department of Radiology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710031，China)

ObjectiveTo establish C6(2.5×105cell/rat)glioma model in two different strains rats(Sprague-Dawley rats and Wistar rats)and to compare the growth patterns of intracranial tumors in order to provide a suitable proexperimental model system for the study of neoplastic gliomas。MethodsThe rats were placed on a stereotactic head holder and C6 cells of glioma were stereotaxically implanted into the right cerebral cortext region of Sprague-Dawley(SD) rats and Wistar rats.After C6 cells inoculation，we observed the living state of rats，tumor volumes，tumor histopathology and the expression of GFAP in tumors by pathology，immunohistochemistry and magnetic resonance imaging(MRI). Results The formation rate of brain tumor was 100%in SD rats and Wistar rats，none of them had distant metastasis. However，the tumor formation time of SD rats was longer than that of Wistar rats and some SD rats with intracranial tumorshad the tendency of spontaneous cure。ConclusionThe Wistar rat C6 glioma resembles human glioma in histopathological and morphological features，therefore，it can be used as an ideal model for studying huaman glioma's pathogenesy and therapeutic strategy.Because the brain tumors formed in SD rats is more like metastatic tumors，and these tumors had the tendency of spontaneous cure，it is not suitable as an experimental model for human glioma.

Glioma;Model，animal;Sprague-Dawley rats;Wistar rats

R-739.41

A

1671-7856(2010)05-0008-04

2009-12-15

國家自然科學(xué)基金(No.60871068)和全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)基金(No.200465)。

王曉武(1972－)，女，博士，高級實(shí)驗(yàn)師。E-mail:xiaowu0330@yahoo.con.cn

郭國禎，男，教授，博士導(dǎo)師，研究方向:電磁輻射生物學(xué)。E-mail:guozhen@fmmu.edu.cn

丁桂榮，女，教授，碩士導(dǎo)師，研究方向:電磁輻射生物學(xué)。E-mail:dingzhao@fmmu.edu.cn