DNCB致敏/激發(fā)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎模型的建立

郭亞南，文海泉

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科，長(zhǎng)沙 410011)

DNCB致敏/激發(fā)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎模型的建立

郭亞南，文海泉

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科，長(zhǎng)沙 410011)

目的 研究外用2，4-二硝基氯苯(DNCB)對(duì)Nc/Nga小鼠的致敏作用，探索建立特應(yīng)性皮炎(AD)模型的方法。方法 外用1%DNCB7周，間隔為1周，重復(fù)刺激并致敏7周大NC/Nga小鼠的雙側(cè)耳朵及背部皮膚。結(jié)果 外用DNCB7周可以引起顯著的炎癥，并伴有高滴度的IgE和IL-4，利用HE染色進(jìn)行組織病理分析，提示表皮炎性細(xì)胞明顯增加。結(jié)論 外用DNCB重復(fù)刺激Nc/Nga小鼠能產(chǎn)生AD樣皮炎，可以作為研究AD病因及治療AD的有效動(dòng)物模型。

特應(yīng)性皮炎;模型，動(dòng)物;Nc/Nga小鼠

特應(yīng)性皮炎(AD)是常見的皮膚病之一，伴有劇烈瘙癢且易復(fù)發(fā)，對(duì)患者生活質(zhì)量影響大。建立合適的動(dòng)物模型是研究 AD的基礎(chǔ)，國(guó)外資料顯示Nc/Nga小鼠可以產(chǎn)生AD樣皮損，血漿內(nèi)IgE、IL-4增高，與人類AD相似。我們采用外用DNCB刺激Nc/Nga小鼠，建立了AD動(dòng)物模型，以期有助于AD治療新藥的研發(fā)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與試劑

從Charles River Laboratories Japan購(gòu)得 6周大SPF級(jí)Nc/Nga小鼠。實(shí)驗(yàn)開始前放置在空調(diào)房間中1周適應(yīng)環(huán)境，房間溫度保持在23℃±3℃，濕度保持在50% ±0%，照明時(shí)間為早8點(diǎn)到晚8點(diǎn)，自由取食。小鼠 IL-4、IgE酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，DNCB購(gòu)自北京市化學(xué)試劑公司，DNCB溶解于丙酮/橄欖油(1∶3)當(dāng)中，濃度為1%。

1.2 方法

皮損誘導(dǎo)參考DNCB誘發(fā)Nc/Nga小鼠皮炎的文獻(xiàn)并稍有改進(jìn)［1］，10只 Nc/Nga小鼠隨機(jī)分成2組(n=5)，模型組:小鼠7周齡時(shí)用1%的DNCB 20 μL涂抹在小鼠足墊及除毛之后的腹部，1周后用DNCB涂抹在小鼠雙側(cè)耳部及背部，每周1次，共6次。對(duì)照組:用丙酮/橄欖油(1∶3)代替DNCB。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 皮損嚴(yán)重程度:觀察各組小鼠皮炎情況并拍照，第14周末，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠耳部厚度。

1.3.2 小鼠搔抓行為:第14周末，將小鼠單獨(dú)放置，觀察10 min內(nèi)小鼠搔抓耳部、背部的次數(shù)，連續(xù)搔抓算作一次。

1.3.3 血清IgE、IL-4的含量:第14周末摘除小鼠眼球，眼眶內(nèi)取血，肝素鈉抗凝血在4℃下3000 r/ min離心30 min，獲取血漿，并保存在 －20℃中，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子的濃度。

1.3.4 組織病理:處死小鼠后，耳部皮損組織用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果(圖1～2見彩插2)

2.1 皮損炎性反應(yīng)

我們的試驗(yàn)表明外用 DNCB第1次刺激 Nc/ Nga小鼠，皮膚無(wú)改變，第2次刺激24 h后，可見耳朵出現(xiàn)腫脹，頸背部出現(xiàn)脫毛及抓痕，隨著刺激的增加，小鼠脫毛范圍擴(kuò)大，并有明顯的糜爛滲血等改變，第7次刺激后，在小鼠頸背部皮膚出現(xiàn)紅斑、滲出、出血和表皮剝脫、脫毛，雙側(cè)耳朵出現(xiàn)明顯腫脹、出血、結(jié)痂;對(duì)照組小鼠皮膚無(wú)明顯改變(圖1)。

圖1 模型組和對(duì)照組小鼠皮損炎性反應(yīng)比較Fig.1 The Ocomparison of skin inflammation between model group(A) and control group(B)

圖2 耳朵HE染色切片（×40）Fig.2 HE stain of ear slice（×40）

2.2 組織病理分析

模型組表皮增厚、過(guò)度角化、細(xì)胞間水腫、表皮和真皮內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);對(duì)照組組織病理無(wú)明顯改變(圖2)。

2.3 血清IgE和IL-4的濃度

與對(duì)照組血漿 IgE濃度(10.96±4.03 ng/mL)相比，外用 DNCB7周后，模型組血漿 IgE濃度(165.65±12.16 ng/mL)顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組血漿與對(duì)照組血漿 IL-4濃度(62.03± 11.15 pg/mL)相比，模型組血漿IL-4濃度(87.75± 2.25 pg/mL)顯著增高(P<0.05)。

2.4 小鼠耳朵厚度和搔抓行為

在用DNCB之后，平均小鼠耳朵厚度為0.75± 0.033 mm，與對(duì)照組(0.24±0.014 mm)相比，差異顯著(P<0.05)。和對(duì)照組小鼠搔抓行為頻次(2.4 ±1.14)相比，重復(fù)外用DNCB7周后，小鼠搔抓行為頻次(18.6±1.82)顯著增加(P<0.05)。

3 討論

特應(yīng)性皮炎，原稱“異位性皮炎”、“遺傳過(guò)敏性皮炎”，是一種與遺傳過(guò)敏素質(zhì)有關(guān)的特發(fā)性皮膚炎癥性疾病。本病表現(xiàn)為劇烈瘙癢、多形性皮損并有滲出傾向，常有易患哮喘、過(guò)敏性鼻炎、濕疹的家族性傾向，對(duì)異種蛋白過(guò)敏，血清中 IgE水平升高，外周血嗜酸性粒細(xì)胞增多。患者Th2細(xì)胞在皮損中顯著增高，其產(chǎn)生的 IL-4和 IL-5增多，可導(dǎo)致 IgE增高和嗜酸性粒細(xì)胞的增多。病因尚不完全清楚，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，兒童發(fā)病與其父母過(guò)敏素質(zhì)明顯相關(guān)。母親一方有特應(yīng)性皮炎者，其子女出生后3個(gè)月內(nèi)發(fā)病率可達(dá)25%以上，2歲內(nèi)發(fā)病率可達(dá)50%以上;如果父母雙方均有特應(yīng)性疾病史，其子女特應(yīng)性皮炎發(fā)病率可高達(dá)79%。外界環(huán)境中的變應(yīng)原(如屋塵螨、花粉等)可誘發(fā)AD，某些患者用變應(yīng)原進(jìn)行皮試可出現(xiàn)皮膚濕疹樣改變。總之，特應(yīng)性皮炎的病因與發(fā)病機(jī)制目前還不很清楚，迫切需要建立一個(gè)合適的動(dòng)物模型，以明確慢性瘙癢的機(jī)制并研發(fā)控制慢性炎性疾病中瘙癢的藥物。以往在AD研究中應(yīng)用的動(dòng)物模型，均為對(duì)正常動(dòng)物反復(fù)致敏而成，它與以特應(yīng)性遺傳素質(zhì)為發(fā)病基礎(chǔ)的AD有著本質(zhì)區(qū)別。

1997年，日本東京農(nóng)工大學(xué)農(nóng)學(xué)部 Matsuda等［2］在世界上首次發(fā)表了與人類AD十分相似的動(dòng)物模型 NC/Nga鼠的研究報(bào)告。Matsuda報(bào)道 NC/ Nga小鼠在普通環(huán)境下飼養(yǎng)可以出現(xiàn)嚴(yán)重的瘙癢，皮膚干燥并有皮膚屏障功能障礙，皮損病理表現(xiàn)為棘層水腫，表皮肥大細(xì)胞增多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血漿IgE和Th2細(xì)胞因子如IL-4水平升高。塵螨是誘發(fā)AD最重要的自然變應(yīng)原，而粉塵螨是其中最普遍的一種。應(yīng)用粉塵螨刺激NC/Nga鼠和BALB/c鼠背部皮膚，每周3次，連續(xù)8周后NC/Nga鼠出現(xiàn)類似AD的皮損和免疫生化改變，而BALB/c鼠僅特異性IgE升高，未出現(xiàn)類似皮損［3］?？梢?，NC/Nga鼠對(duì)外界抗原的免疫反應(yīng)與AD患者類似。

近來(lái)的多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，在普通環(huán)境下飼養(yǎng)時(shí)，并非所有NcNga小鼠都能自發(fā)產(chǎn)生 AD樣皮損［4－6］，需應(yīng)用半抗原或者螨蟲抗原激發(fā)穩(wěn)定的濕疹。我們采用1%DNCB重復(fù)刺激Nc/Nga小鼠的方法，以誘發(fā)小鼠皮炎。通過(guò)觀察小鼠皮膚，測(cè)量耳朵厚度及其搔抓行為，評(píng)價(jià)炎性程度，并檢驗(yàn)血漿內(nèi)IL-4、IgE的含量來(lái)判斷模型是否制作成功。試驗(yàn)顯示我們從日本Charles River Laboratories Japan引進(jìn)的Nc/Nga小鼠，在普通環(huán)境中生長(zhǎng)7周，均未發(fā)現(xiàn)小鼠的明顯搔抓行為，皮膚沒(méi)有紅斑、丘疹、結(jié)痂、鱗屑等改變，說(shuō)明此鼠在普通環(huán)境下生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的皮炎產(chǎn)生，與上述發(fā)現(xiàn)相似。我們第一次應(yīng)用DNCB刺激小鼠足墊及除毛的腹部后1周內(nèi)，局部皮膚未出現(xiàn)任何炎性反應(yīng)，說(shuō)明 DNCB對(duì)皮膚沒(méi)有直接損傷。重復(fù)外用DNCB7周，可以引起Nc/Nga小鼠明顯的濕疹樣改變，耳部、頸、項(xiàng)、背部出現(xiàn)脫毛、紅斑、滲出、表皮剝脫、結(jié)痂，雙側(cè)耳朵出現(xiàn)腫脹、出血、結(jié)痂等表現(xiàn);組織 HE染色顯示小鼠表皮增厚、過(guò)度角化、細(xì)胞間水腫，表皮和真皮內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。上調(diào)血漿中IgE和IL-4的濃度，同時(shí)伴有搔抓行為的增加。這種慢性瘙癢性皮損并伴隨 IgE和 IL-4的增高，提示此模型為Th2型細(xì)胞反應(yīng)占優(yōu)的炎癥，與人類特應(yīng)性皮炎有相似之處。

總之，我們通過(guò)外用DNCB刺激Nc/Nga小鼠，成功的建立了 AD樣慢性瘙癢性模型，這個(gè)模型對(duì)于研發(fā)治療AD的新藥是一個(gè)有效的工具。

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Establishment of Atopic Dermatitis Model with Nc/Nga Mice Sensitized and Challenged with DNCB

GUO Ya-nan，WEN Hai-quan
(Department of Dermatology，Central South University XiangYa Second Hospital，Changsha 410011，China)

Objective To determine the effect of DNCB in the Nc/Nga mice and to explore the ways of establishing AD models.Methods DNCB was repeatedly applied to the ear of NC/Nga mice.Atopic dermatitis-like skin lesions were evaluated by ear thickness，skin histology and immunological parameters.Results Repeated application of DNCB caused rapid increase in ear thickness.Clinical and histological symptoms(dermal and epidermal thickening，hyperkeratosis，parakeratosis and inflammatory cell infiltration)in this model were very similar to those in human atopic dermatitis.Serum IgE and IL-4 levels were elevated in this model compared with normal mice.Conclusions These results suggest that our model is useful for elucidating the pathogenesis of atopic dermatitis.

Atopic dermatitis;Model，animal;Nc/Nga mice

book=12,ebook=1

R758.23

A

1671-7856(2010)05-0012-03

2009-12-15

郭亞南(1976－)，男，博士，從事斯奇康治療特應(yīng)性皮炎的機(jī)理研究。

文海泉(1945－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事炎癥性皮膚病的研究。